指紋圖譜在茶葉研究上的運用

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GC-MS指紋圖譜技術通過分析茶葉香氣，在茶葉質量評價和身份鑒定方面有一定作用。GC的優勢在于揮發性成分的測定，對于茶葉中不揮發性成分，可用裂解氣相色譜進行測定。張銘光等[8]采用熱脫附-裂解色譜法測定了普洱茶色譜指紋圖譜，并選用模糊聚類數據處理手段對圖譜進行綜合分析，該指紋圖譜能較好地反映普洱茶因產地、工藝加工、存放地點、存放時間所產生的差異，為普洱茶的品質鑒定提供了一種快速、簡便、科學的測試手段。

與GC相比，除了同樣具有分離效能高、分析速度快等特點外，高效液相色譜（HPLC）不受樣品揮發性和熱穩定性限制，應用范圍廣，60%~70%的有機化合物均可應用，并且通過與不同檢測器聯用，可以有針對性地檢測分析樣品中不同的化學成分。如使用二極管陣列檢測器（DAD），可以得到不同波長下的色譜圖，計算機處理后可獲得三維圖譜，適用于成分復雜物質的定性和定量分析[9]。HPLC方法應用于茶葉組分分析時間并不久，直到1976年Hoefler和Coggon[10]才首次采用液相色譜法測定了茶葉中組分，為茶葉指紋圖譜分析提供了研究方向。Pedro等[11]采用HPLC分析法對肯尼亞、印度、日本等國家以及中國云南的普洱茶、福建的烏龍茶等進行了產地區分的判別研究。羅一帆[12]根據高效液相色譜中的相對保留時間、相對面積、共有峰、重疊率、八強峰及相對總面積等對廣東嶺頭單樅茶的色譜指紋圖譜進行了分析和對比研究，建立了鑒定廣東嶺頭單樅茶品種的色譜指紋圖譜分析方法。茶多酚的藥理藥效越來越受到人們關注，何昱等[13]對33批茶多酚進行了高效液相色譜指紋圖譜分析，并結合主要單體成分的含量檢測，制作了數字化指紋圖譜，認為該圖譜可以作為茶多酚產品質量控制的依據。除此之外，還通過高效液相色譜法獲得綠茶特征圖譜，并以數字化色譜指紋圖譜為基礎，探討了綠茶分類新模式，從內在組成上為綠茶的分類提供了一個客觀量化的界定標準[14]。HPLC指紋圖譜在茶葉研究中主要是通過測定茶葉中兒茶素、茶多酚等特征成分含量，提取茶特征成分并與模式識別方法相結合判別茶葉品種和產地。成浩等[15-16]在這方面做了很多研究，在產地識別方面，以不同類別的扁形綠茶樣品為研究對象，從兒茶素和黃酮苷兩類物質著手，通過大量樣本分析研究，建立了不同的數字化多元HPLC化學指紋模式圖譜，能較好地代表其來源樣本的特征屬性；在綠茶原料品種屬性鑒別技術方面，建立的綠茶HPLC多元化學指紋圖譜能夠較好地表征茶葉樣本的品種屬性[17]；針對武夷巖茶分類識別的研究，借助HPLC色譜數據的多元信息融合，建立了武夷巖茶不同原料品種、不同產地區域的分類判別模型，模型對訓練集樣本的判別準確率達到100%[18]；在普洱茶分類研究方面，利用茶多酚類、咖啡堿及黃酮類物質含量變化的兩個HPLC色譜數據，制作了滇青（曬青毛茶）、青餅和普洱茶（熟餅）3組茶樣的化學指紋圖譜，發現1~2年陳以內的青餅在化學成分上與普洱茶（熟餅）有著本質上的差異，而與曬青毛茶有很高的相似度，本質上還是屬于綠茶[19]。寧井銘[20]對曬青毛茶的分類鑒別進行了相關研究，通過對18個云南普洱茶曬青毛茶樣品HPLC圖譜的分析，確定了普洱毛茶的特征指紋峰，與綠茶比較，二者HPLC圖譜存在較大的差異，所得色譜圖可以作為云南毛茶專屬性的指紋圖譜，為普洱毛茶鑒別和質量控制提供了實驗依據。在此研究基礎上，張梁[21]建立了普洱茶HPLC指紋圖譜方法，通過對不同產地的普洱生茶和普洱熟茶的研究分析，發現不同產地的普洱熟茶和普洱生茶分別有24個共有峰和21個共有峰，并且兩者因不同的發酵工藝又產生了各自特征性的指紋峰。所以，該法可以用于普洱熟茶和普洱生茶的質量評價和真偽鑒別。隨著高效液相色譜儀器的普及，與質譜（MS）聯用可同時得到色譜峰的結構信息，使茶葉成分分析更加深入細致。Zhu等[22]建立了茶葉及其提取物中茶氨酸、綠原酸、嘌呤堿類和兒茶素類12種化合物的HPLC和HPLC-MS分析方法，通過該法獲得的譜圖可以作為茶葉及其提取物中生物活性成分質量控制的指紋圖譜。倪倩[23]采用高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）及高效液相色譜法對生熟普洱茶中的8種主要成分進行定性和定量分析，并結合主成分分析（PCA）、聚類分析（CA）和判別分析方法，能準確地區分普洱生茶與熟茶。

毛細管電泳（CE）是以毛細管為分離通道，以高壓電場為驅動力的新型液相分析技術。毛細管電泳作為一種快速、高效、微量、經濟的分離技術，在茶葉成分分析中已有較多應用，其中毛細管區帶電泳（CZE）和毛細管膠束電動色譜（MEKC）是最常用的兩種模式。利用CZE分離模式，可以分析茶葉中多種生物活性成分，包括6種兒茶素類[兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）]、4種茶黃素、茶氨酸、咖啡堿、茶堿、腺嘌呤和多種酚酸[24-27]，以及水溶性維生素[28]。MEKC與CZE相比，不但可以分離帶電物質，還可以分離電中性的物質，它可以同時分離8種兒茶素類、咖啡堿、茶堿、可可堿[29]，但MEKC對茶黃素類的分離效果不佳[30]。宋冠群[31]用膠束電動色譜法建立了茶葉的色譜指紋譜，并用于分析10種中國名茶，實現了圖譜的數據化；同時以相對保留值表示各色譜峰的峰位，提高了樣品間的可比性。

紅外光譜是指波長范圍在400~4000cm-1之間的中紅外區，因為具有良好的指紋性，所以只要茶葉的化學成分在質和量方面相對穩定，且樣品前處理方法統一，其紅外光譜是相對穩定的。依據此特性，張俊瑜[32]利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法獲取了不同廠家不同年份3種普洱紅茶的特征紅外光譜，并發現對同一加工方式生產的紅茶，隨著存儲時間的延長，其特征譜的差異就越明顯。所以，該研究對鑒別茶葉真偽和存儲年份有一定參考價值。近紅外光（NIR）是指波長介于可見光區與中紅外光區之間的電磁波，其關注的波數范圍為4000~12500cm-1，因其具有快速簡便、對樣品無破壞性、無污染、成本低等特點，近年來發展迅速。茶葉中的主要成分含有近紅外的主要吸收官能團含氫基團，因此根據不同茶葉在近紅外區的光譜特征不同，可以將近紅外區的光譜信息應用于茶葉定性定量分析品質檢驗工作中。Hall[33]對134個紅茶樣品進行了近紅外光譜分析，通過對紅茶水分含量、茶黃素含量和感官品評來評價紅茶的來源和品質。夏賢明[34]用近紅外光掃描對40個綠茶試樣進行分析，建立了綠茶總氮量、游離氨基酸、咖啡堿、茶多酚這4種成分的近紅外定標模型。通過標準化學法驗證，得出近紅外法和化學法測定結果差異不顯著，確認了近紅外光譜法可用于綠茶品質檢驗。Schulz[35]用近紅外反射光譜分析綠茶的品質參數，建立測定茶多酚、氨基酸和咖啡堿的模型，結合主成分分析法，能夠辨別不同樹齡的茶葉。Li等[36]用可見/近紅外無損檢測技術對200個茶葉軟飲料試樣的可溶性固形物含量進行測定，并采用偏最小二乘（PLS）和多元線性回歸（MLR）的多變量分析方法，建立了茶軟飲料的回歸模型和指紋圖譜。王勝鵬[37]還把近紅外光譜技術用于茶鮮葉原料的質量評價。通過建立近紅外光譜與茶鮮葉含水量、全氮量和粗纖維含量間的相關性模型和質量系數方程來評價鮮葉嫩度，提出了用質量系數作為評價鮮葉質量高低的參數，為茶鮮葉原料收購和加工分級等工作提供了新思路。近紅外技術除了用于茶葉及茶產品的質量品質評價工作，還用于茶葉的分類研究和品種鑒別工作。陳全勝和趙杰文[38-41]用近紅外光譜技術分別結合主成分-馬氏距離模式、軟獨立模式分類法（SIMCA）和支持向量機（SVM）識別方法，對龍井、碧螺春、毛峰、祁紅、鐵觀音進行有效鑒別，對綠茶、紅茶、烏龍茶識別準確度可達90%以上。李曉麗[42]應用可見-近紅外光譜儀在325~1075nm范圍內測定西湖龍井、羊巖勾青、雪水云綠等5個品種茶葉的光譜特征曲線，并結合主成分分析人工神經網絡建立了茶葉品種鑒別的模型，識別率達到100%。何勇等[43]在相同的近紅外光譜范圍，用主成分分析（PCA）得到的8個主成分作為輸入因子，以8個品種200份綠茶樣品建立了一個反向傳播人工神經網絡（BP-ANN）判別模型，對40份未知茶樣品種預判準確率達到100%。周健等[44-47]用近紅外光譜技術結合不同的數據分析方法，在茶葉的分類識別和真偽鑒定方面做了深入的研究，他們利用杠桿率校正結合偏最小二乘法（PLS-DA），對武夷巖茶中的正巖茶與半巖茶識別正確率達到100%；通過主成分分析法（PCA）建立的Fisher識別函數對成品茶原料品種的定標集和驗證樣本的識別準確率分別為96.8%和93.5%，對地理標志茶樣的訓練集和驗證集的識別準確率均達96.7%；采用PLS法建立的西湖龍井的預測模型，對其真偽的鑒定準確率達到100%，為其他名茶真偽鑒定的參考。對滇青、青餅和普洱茶（熟餅）的近紅外化學指紋圖譜的研究中，周健[48]采用歐氏距離、PCA和系統聚類等方法對其進行了定性判別分析，得出青餅的近紅外光譜與普洱茶（熟餅）樣品差異顯著，而與其原料滇青（曬青毛茶）十分接近，這與普洱茶HPLC指紋圖譜分類研究的結果[19]一致。除此之外，He[49]和周健[50]還提出兩步法對茶葉進行品種或產地判別，這為原產地標識茶葉的鑒別工作提供了新思路。試驗對西湖龍井、錢塘龍井、越州龍井和扁形綠茶4個類型的茶樣進行近紅外光譜分析并建立判別模型，首次判別使用PLS法，對定標集和驗證集樣本的識別準確率分別為95.28%和93.68%，對不能識別的茶樣再利用歐氏距離法進行二次判別，最后對校正集和驗證集茶樣總的識別準確率達到98.43%和96.84%。用同樣的方法對4個茶葉樣本的原料品種進行識別，其準確率分別為90.3%（定標集）和83.5%（驗證集）。由此可見，利用近紅外技術結合多種分析模式，可實現茶葉的快速分類判定和真偽鑒定。

NMR是一種吸收光譜，可以檢測多種核素，是鑒定有機化合物結構的常規方法和重要手段，在茶葉指紋圖譜研究中主要用于茶葉特征成分的分析。Gall[51]首先報道了用NMR對191種綠茶的代謝產物進行描述，通過PCA與聚類分析（CA）顯示龍井茶與大多數其他中國綠茶具有顯著差異，與其他茶葉相比，龍井茶中茶氨酸、沒食子酸、咖啡堿、EGCG、ECG含量較高，EGC含量較低；龍井茶中還發現有茶沒食子素、可可堿和一些含糖化合物，這些特征成分有助于茶葉的身份鑒定。Lee等人[52]用1HNMR研究韓國濟州島3個不同茶葉產區的茶葉代謝產物，根據氨基酸、兒茶素類和咖啡堿等特征成分含量的不同，利用PCA和正交投影潛結構判別分析（OPLS-DA）等模式識別技術，可正確識別茶葉所在產區。由此可見，通過研究茶葉特征代謝產物來識別茶葉身份是可行的。陳波等[53]用1HNMR分析測定35種不同種類和產地的茶葉，檢測出約20種物質，包括兒茶素類、茶氨酸、糖類、脂肪酸、咖啡堿等，所得譜圖通過主成分分析實現了不同種類茶葉的區分以及鐵觀音產地的辨別，結果具有較好的重現性。陸瑋潔[54]依據1HNMR指紋圖譜與茶葉品種之間存在著較好的對應關系，利用共有峰率和變異峰率雙指標序列法分析了29份不同種類、不同產地茶葉樣品的1HNMR指紋圖譜，能夠對綠茶和紅茶的品質進行準確的鑒別。

光譜法具有靈敏度高、分析速度快、檢出限低、適合微量和超微量分析及同時測定多種元素或化合物等特點。光譜指紋圖譜中除了常用的紅外光譜、核磁共振之外，還有紫外-可見光譜（UV-Vis）、電感耦合等離子體發射光譜（ICP-AES）和熒光光譜。其中，紫外-可見光譜通常作為檢測器與高效液相、毛細管電泳技術聯用來建立物質的指紋圖譜。熒光光譜法具有速度快、取樣量少、選擇性好等優點，已從茶葉成分檢測運用到茶葉品質鑒別中。唐心亮[55]運用三維熒光光譜技術建立了15種茶葉樣本的三維熒光譜及其等高線指紋譜，選取圖譜中的4個峰值作為指標變量進行主元分析，驗證了運用三維熒光光譜技術和主元分析方法實現多種綠茶品質鑒定和種類區分的可行性。茶葉中富含多種礦物質和微量元素，其含量與生長環境密切相關，所以，用ICP-AES法研究茶葉中的微量元素對茶葉品質鑒定和產地識別有重要意義。Moreda-Pineiro等[56]通過ICP-AES和ICP-MS法測定來自亞洲和非洲等地的85個茶葉樣本中的Al、Ba、Ca等17種金屬元素的含量，結合不同的模式識別技術，對地理原產地茶進行了分類研究。以PCA和CA為探索性技術，線性判別分析（LDA）和軟獨立模式分類法（SIMCA）為分類手段，得出在5%的顯著性水平，LDA和SIMCA對非洲茶樣分類的正確率為100%，對亞洲茶樣分類正確率分別為94.4%和91.7%。但在外部樣本的判別分類上，SIMCA法不能區分印度和斯里蘭卡的茶樣。Chen[57]利用元素指紋識別技術，通過ICP-AES法測定茶葉中的Al、B、Ca等15種元素含量，結合PCA、聚類分析、LDA、反向傳播神經網絡（BPNN）的多元統計分析方法，得到8個不同茶葉品種特定元素指紋，可以用于茶葉品種鑒別。McKenzie等[58]采用ICP-AES法測定白茶、綠茶、紅茶、烏龍茶和普洱茶中的Al、Ba、Zn等14種元素含量，用LDA和概率神經網絡（PNN）構建的分類模型對5種茶葉的識別率分別達到81%和97%。

指紋圖譜分析技術除了色譜和光譜，還有電化學檢測技術、電子鼻技術等。電化學檢測簡便、易于實現自動化，適用于茶葉的在線分析。趙哲[59]用非線性電化學振蕩檢測方法，通過“溴酸鈉-硫酸錳-硫酸-丙酮”穩態體系，獲得不同廠家、不同品種茶飲料的非線性化學指紋圖譜，該方法能將冰紅茶從其他茶飲料中鑒別出來，并且分析不同摻水量的茶飲料的非線性化學指紋圖譜的參數信息，可以對茶飲料的質量進行評價。電子鼻是一種新型仿生檢測儀器，可以模擬人的鼻子檢測茶葉香氣品質。Yu等[60]利用電子鼻技術對不同質量等級的綠茶進行了測定，采用BP神經網絡、概率神經網絡和聚類分析法來分析不同的茶樣，發現電子鼻技術對不同茶葉樣本有不同的響應，據此可實現茶葉不同等級的評定。史波林[61]運用電子鼻技術分析西湖龍井茶香氣特征，通過頂空瓶內茶水直接混合的香氣制備法、合理選擇電子鼻頂空進樣及信號采集參數等方法，利用軟獨立建模分類法（SIMCA）建立不同等級西湖龍井茶判別模型，等級分類正確率高達95%以上，實現了西湖龍井茶的智能分等分級。4問題與展望指紋圖譜技術作為近年來的一個研究熱點，在茶葉上的應用研究雖然取得了一些成效，但尚處于起步階段，要讓茶葉指紋圖譜技術走出實驗室，應用于生產實踐，還有一段路要走。主要基于以下幾點原因：一、茶葉種類繁多，成分復雜且不穩定。茶葉品質受種植環境、栽培措施、采摘方法、加工工藝以及貯存條件等多種因素影響，產品質量很難穩定，尤其發酵類茶葉，內在成分本身就具有不穩定性。所以，目前茶葉指紋圖譜研究的模型適用范圍較小，有一定的局限性。面對這些不穩定因素和繁雜的成分，如何保證指紋圖譜的重現性？科學準確地評判茶葉品質？這些問題還需進一步思考和解決。二、不同技術所得指紋圖譜之間的關系還需要研究。指紋圖譜技術檢測手段多樣，從色譜到光譜；分析方法由一維發展到多維；檢測技術也由單一應用發展到聯用技術。而各種檢測技術對同一樣品指紋鑒定結果的相關性分析還沒有開展類似的研究。

茶葉指紋圖譜的標準化建設難，還需要大量的研究工作。首先，建立不同茶葉的標準指紋圖譜工作較難。受儀器種類、品牌、分析條件和樣品前處理方法等因素影響，分析方法和條件不同，指紋圖譜就會有差異，實現標準化較難。其次，數學建模方法的適用性還需要研究。用于指紋圖譜技術的數據處理方法主要有相似度分析、主成分分析、聚類分析、人工神經網絡等，在茶葉分類研究、品質分析和質量控制中的適用性和判定的準確性還需要進一步評估。最后，茶葉指紋信息數據庫的建立需要進行大批量茶葉樣本的研究和長時間的數據積累。茶葉指紋圖譜技術的研究雖然剛起步，但因其具有整體性、模糊性和可量化等特點，在茶葉感官評審、種類識別、品質鑒定、真偽辨別和過程控制等方面都有廣闊的應用前景。未來茶葉指紋圖譜技術的研究對象會以茶葉產品為中心，向整個茶葉產業輻射開來，比如對茶飲料的在線監測，對茶保健品的質量控制等。分析方法會隨著儀器分析技術和計算機信息處理技術的發展，更科學準確。同時，多種分析技術優勢互補也會為指紋圖譜技術在茶葉上的應用發展提供助力，推進我國茶葉產業質量控制的標準化進程。（本文作者：劉英、吳曙光、尹州、吳廣紅、曹麗芬 單位：杭州市余杭區質量計量監測中心）