卵泡細(xì)胞發(fā)育醫(yī)學(xué)檢驗論文
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一、材料和方法
（一）卵泡的采集和組織切片。
從有規(guī)則產(chǎn)蛋周期的三黃母雞中取出等級前卵泡，按照其直徑分為小白卵泡（SWF，1～3mm）、大白卵泡（LWF，3～5mm）、小黃卵泡（SYF，5～6mm）和大黃卵泡（LYF，6～9mm）。各級卵泡用4%多聚甲醛固定24h，然后切片，片厚5μm。經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并用顯微數(shù)字成像系統(tǒng)攝像，將圖像傳送到計算機中。用SimplePCI高級圖像分析軟件測量卵泡顆粒層和膜層的厚度，以及顆粒細(xì)胞的密度。
（二）卵泡的培養(yǎng)和激素處理
等級前卵泡取出后，用生理鹽水漂洗干凈，以1卵泡/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板。根據(jù)卵泡直徑將發(fā)育階段相近的卵泡隨機分為2組，即對照組和FSH處理組。培養(yǎng)液為含0.5％胎牛血清（FCS）的M199培養(yǎng)液（Hyclone）。預(yù)培養(yǎng)16h后，撤去血清，換用含10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉的ITS培養(yǎng)液。培養(yǎng)液還添加了1.75mmol/LHepes、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。卵泡置于39℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的同時用10ng/mLFSH處理48h。每個處理組4孔，實驗重復(fù)3次。
（三）5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷免疫組織化學(xué)
卵泡懸浮培養(yǎng)48h后加入終濃度為15μg/mL的BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后用4%多聚甲醛固定，進行切片。切片用3%H2O2溫育30min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下用山羊血清封閉20min后加入甲酰胺100℃變性核酸5min，冰水浴冷卻后，加入小鼠抗BrdU抗體，4℃過夜后滴加羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育20min，用DAB顯色劑室溫顯色，陽性細(xì)胞呈棕紅色，計算出陽性細(xì)胞的百分比。
（四）數(shù)據(jù)分析
所得數(shù)據(jù)采用SAS軟件中GLM過程進行方差分析和Duncan氏多重比較，檢驗誤差為5％和1％水平。
二、實驗結(jié)果
（一）等級前卵泡膜層和顆粒層的形態(tài)學(xué)變化
等級前卵泡組織學(xué)研究結(jié)果表明，SWF只有1層顆粒細(xì)胞，LWF中出現(xiàn)2層顆粒細(xì)胞，而SYF和LYF中則有多層顆粒細(xì)胞。基膜外側(cè)的結(jié)締組織分化形成卵泡膜層，其中的膜細(xì)胞則隨著卵泡級別的增加而成為多層，并分化為內(nèi)膜細(xì)胞層和外膜細(xì)胞層。同時數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，卵泡膜層和顆粒層厚度隨著卵泡直徑的變大而顯著增加，并且顆粒細(xì)胞的密度也呈現(xiàn)相似的變化趨勢
（二）等級前卵泡顆粒細(xì)胞BrdU標(biāo)記指數(shù)的變化
等級前卵泡BrdU摻入實驗結(jié)果表明，隨著卵泡直徑增加，顆粒細(xì)胞BrdU標(biāo)記指數(shù)顯著增加，即顆粒細(xì)胞的增殖活性隨等級前卵泡的發(fā)育而增強。
（三）FSH對卵泡細(xì)胞增殖的影響
等級前卵泡用10ng/mLFSH處理48h，然后進行的組織學(xué)研究和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明，與對照組相比，F(xiàn)SH處理組LYF中顆粒層的厚度增厚19.7%。隨著FSH處理劑量的增加，SYF和LYF中顆粒細(xì)胞的密度分別增加25.7%和30.3%。但是在卵泡體外培養(yǎng)過程中，F(xiàn)SH處理后卵泡膜層的厚度則沒有顯著變化。
三、結(jié)論
卵巢中卵泡是生長最快的正常組織之一，而與卵母細(xì)胞一起構(gòu)成卵泡的體細(xì)胞的發(fā)育則是其生長的主要原因。本實驗對產(chǎn)蛋母雞等級前卵泡的組織切片結(jié)果顯示了小卵泡中卵泡細(xì)胞的發(fā)育進程。SWF僅有1層立方狀的顆粒細(xì)胞，與卵母細(xì)胞組成初級卵泡；LWF、SYF和LYF中顆粒層細(xì)胞增至2～3層，并且顆粒細(xì)胞數(shù)目顯著增加，從而形成次級卵泡。本實驗還顯示，隨著卵泡體積的增加，膜細(xì)胞增殖為多層并分化為功能完全不同的內(nèi)膜細(xì)胞和外膜細(xì)胞層。以上結(jié)果表明卵泡體細(xì)胞的生長變化是卵泡發(fā)育的重要標(biāo)志。FSH在維持和調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育中起著重要作用。FSH可促進卵巢顆粒細(xì)胞的增殖。用碘化FSH作自顯攝研究證實，F(xiàn)SH的結(jié)合部位首先出現(xiàn)在顆粒細(xì)胞，可見卵巢中主要是顆粒細(xì)胞表達(dá)FSH受體。FSH以劑量-效應(yīng)關(guān)系促進雞顆粒細(xì)胞的增殖。最近的研究報道，F(xiàn)SH通過Akt信號途徑上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D2的表達(dá)和抑制AMPK的活性，最終刺激顆粒細(xì)胞的增殖。本實驗采用體外卵泡懸浮培養(yǎng)，研究了FSH對卵泡細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，10ng/mLFSH顯著增加SYF和LYF中顆粒層的厚度以及顆粒細(xì)胞的密度，但FSH對卵泡膜細(xì)胞則沒有顯著的促增殖作用。由此可見，F(xiàn)SH對小卵泡的發(fā)育具有階段和細(xì)胞類型特異性，即FSH顯著促進即將進入等級前卵泡中顆粒細(xì)胞的增殖，從而加速卵泡的發(fā)育。總之，本實驗通過體內(nèi)和體外研究顯示了等級前卵泡中膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并證明FSH能顯著刺激SYF和LYF中顆粒細(xì)胞的增殖，促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。