生物醫學雞胚運用分析

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1資料和方法

1.1資料來源

由第一作者在2011-06進行檢索。檢索數據庫：PubMed數據庫，網址www.ncbi.nlm.gov/PubMed；CNKI數據庫，網址www.cnki.net/；英文資料的檢索時間范圍為1967/2011；中文資料的檢索時間范圍為1990/2011。英文檢索詞為“chickenembryochorioallantoicmembranemodel;neuronalculture”；中文檢索詞為“雞胚絨毛尿囊膜，模型；神經細胞培養”。

1.2入選標準

納入標準：①雞胚培養方法的應用。②神經細胞培養的研究。③疾病模型。排除標準：①與此文目的無關。②較陳舊的文獻。③重復同類研究。

1.3質量評估

基礎研究和疾病模型研究原著163篇，綜述40篇，述評2篇。

2結果

2.1納入文獻

基本情況初檢得到205篇文獻，中文123篇，英文82篇。閱讀標題和摘要進行初篩，排除因研究目的與此文無關112篇，內容重復性的研究59篇，共保存34篇中英文文獻做進一步分析。文獻[1-2]研究了雞胚的組織結構特點，文獻[3-30]篇分析了雞胚在腫瘤研究、病毒培養、藥物作用研究領域的應用，文獻[31-34]篇利用雞胚研究了氧化應激模型及子宮內膜移位癥雞胚模型。

2.2結果描述

2.2.1雞胚的組織結構特點雞胚一般是雞的受精卵從開始孵化到雛雞的階段，該階段20~21d。雞胚有3個胚層發育而成，在發育的不同階段具有不同的結構特點。實驗中應用第5~11天的雞胚較多，在該階段雞胚具有胚體、羊膜、絨毛膜、尿囊和卵黃囊等結構，外面被覆殼膜和殼。第10天絨毛膜與尿囊合并為絨毛尿囊膜，主要由3層構成：外胚層，緊貼殼膜，由一到兩層絨毛膜上皮構成；中胚層，富含大量毛細血管和間質細胞；內胚層，面向尿囊腔，是一層扁平的內皮。絨毛尿囊膜緊貼多孔的殼，其中的血管網通過尿囊動脈和靜脈與胚體的循環相連，是雞胚的呼吸器官。該結構保證了足夠的氣體和養分交換，也使其能夠有效的支持移植物的生長，從而成為多種實驗的良好模型。卵黃囊是雞胚的營養器官，含有豐富的血管網為雞胚提供營養物質。雞胚的免疫系統由T細胞介導的細胞免疫和B細胞介導的體液免疫構成。B細胞在相當與哺乳動物骨髓的法氏囊中分化，T細胞在胸腺分化。至孵育的第10天，雞胚的免疫系統尚未完全建立，孵育的第11天后才能檢測到T細胞和B細胞[2]，至第18天免疫系統方初步建立。這一特點使雞胚在孵育的早期不對異物產生排異反應，有利于移植物的生長。

2.2.2雞胚在腫瘤研究領域的應用雞胚在腫瘤研究中的應用主要有腫瘤血管生成，腫瘤種植與轉移，腫瘤侵襲等方面。目前認為腫瘤的血管生成在腫瘤的生長與轉移中起主要作用。腫瘤的生長需要新生血管來提供養分，氧氣和排泄代謝廢物。如果沒有新生血管形成，原發腫瘤的大小一般不超過2mm×2mm×2mm。對腫瘤血管生成的研究分為促進血管生成和抑制血管生成兩個方面。血管生成的反應表現為圍繞移植物的輻輳放射狀血管生成和血管密度增加[3]；抑制血管生成的反應為血管減少，密度降低直至消失。Vacca等[4]用絨毛尿囊膜模型來研究漿細胞條件培養基誘導血管生成的能力，發現活動性骨髓瘤患者的條件培養基較非活動性骨髓瘤患者的條件培養基能顯著促進血管的生成。他們還進一步發現多發性骨髓瘤的促血管生成反應和某些內源性血管生成抑制因子的缺失有關[5]。Ribatti等[6]通過把不同神經母細胞瘤患者的活檢腫瘤組織移植入絨毛尿囊膜，證實有癌基因MYCN擴增者比無MYCN擴增者具有更顯著的促血管生成作用。Kern等[7]應用絨毛尿囊膜模型研究發現硼替佐米(bortezomib,蛋白酶體抑制劑)有很強的抗血管生成作用，但這一作用可以被GRP-78因子所拮抗。通過構建各種腫瘤的絨毛尿囊膜模型，雞胚在腫瘤的種植與轉移的研究中也有廣泛的應用。絨毛尿囊膜模型最早由Knighton等[8]提出，近年來國內外學者已成功的建立卵巢癌絨毛尿囊膜模型[9]、胃癌絨毛尿囊膜模型[10]、前列腺癌絨毛尿囊膜模型[11]，鼻咽癌絨毛尿囊膜模型[12]，骨肉瘤絨毛尿囊膜模型等[13]。腫瘤組織來源不同構建模型所需最佳條件有所區別，有文獻報道黑色素瘤細胞株、前列腺癌細胞株接種細胞數在105~106就可以有較好的成瘤效果[11,14]；膽管癌細胞須在4×106時才能較好的形成移植瘤[15]；卵巢癌要求更高，需要107~108才形成移植瘤[10]；所以在建立不同腫瘤細胞的絨毛尿囊膜模型時要首先摸索出模型建立的最佳條件。這些模型的建立對研究腫瘤的種植與轉移提供了很好的在體模型。Taizi等[16]利用白血病絨毛尿囊膜模型，通過DNA的定量分析，研究了白血病對各個臟器的侵襲情況。也有學者運用絨毛尿囊膜模型研究了腫瘤侵襲轉移的關鍵環節，如癌細胞通過循環系統轉移到靶器官[17]；轉移的癌細胞通過血管壁轉移到細胞間質和靶器官[18]；腫瘤細胞在靶器官內的增殖等[19]。

2.2.3雞胚在病毒培養疫苗生產中的應用雞胚適于部分敏感病毒的生長，長期以來被大量用于流感病毒等的培養和疫苗的生產。應用雞胚材料進行病毒培養有兩種方法：一種是直接接種在雞胚的不同部位，如尿囊腔、羊膜腔等；一種是接種在體外培養的雞胚細胞中，如成纖維細胞。郭芳等[20]應用雞胚尿囊腔和羊膜腔接種法比較了流感病毒的雞胚培養和細胞培養兩種分離方法的異同。發現雞胚培養法較細胞培養法具有病毒易復制，接種部位病毒含量大，對病毒不產生抗體，來源充足，操作簡單等優點。Meyer等[21]利用原代雞胚成纖維細胞培養修飾的安卡拉痘苗病毒，經過一系列的傳代得到了安卡拉痘苗。萬學勤等[22]也利用雞胚成纖維細胞培養新城疫病毒來進行抗腫瘤新城疫病毒疫苗的研究。富強等[23]從細胞病變和抗原滴度兩個方面比較了雞胚肝細胞培養禽腺病毒和SPF雞腎細胞培養禽腺病毒，兩者并無明顯差異，可以用雞胚肝細胞培養禽腺病毒來替代傳統的SPF雞腎細胞培養法。黃杰庭[24]利用SPF雞胚進行了中國首例甲型H1N1病毒的分離培養和鑒定。目前常用的疫苗中有些是通過病毒接種雞胚培養法生產的，但是并非所有世界衛生組織公布推薦的疫苗株在雞胚培養的過程中都具有良好的病毒復制能力。研究發現在雞胚中能夠良好復制的流感毒株通常在HA蛋白基因序列上和能夠在人群中流行的毒株存在一個或多個氨基酸位點差異[25]。尋找在雞胚中復制良好的高產株或者通過不同毒株之間的重配來獲得在雞胚上有良好復制能力的毒株也是目前利用雞胚生產疫苗研究的熱點。

2.2.4雞胚在藥物作用研究中的應用雞胚在藥物作用的研究主要有抗腫瘤藥物和活血化瘀中藥的研究。有學者利用黑色素瘤絨毛尿囊膜模型研究了內皮抑素和多西環素對腫瘤血管生成的影響[26]。李穎嘉等[27]過骨肉瘤OS-732細胞絨毛尿囊膜模型研究發現，血管內皮生長因子抗體對骨肉瘤血管生成及腫瘤增殖、凋亡狀態均有顯著影響；血管內皮生長因子抗體組腫瘤去血管數目及瘤細胞數顯著低于PBS對照組。Amin等[28]通過絨毛尿囊膜模型研究發現甘氨酸能抑制50%以上的胚胎血管形成，使損傷修復血管形成中所需要的纖維蛋白的形成減少30%以上。同時發現能使乳腺癌的生長減少15%，微血管密度下降20%。提示甘氨酸具有抑制胚胎血管形成，抑制損傷修復和腫瘤生長的作用。李漢青等[29]應用絨毛尿囊膜模型用pH梯度法對復方三黃膠囊抑制腫瘤血管生成的活性部位進行了比較，發現用乙酸乙酯萃取的酸性部位復方三黃膠囊具有顯著的抑制雞胚絨毛尿囊膜細小毛細血管的作用。董紀軍等[30]用雞胚心侵襲實驗法研究了雌二醇對SAcc83細胞轉移的影響，發現雌二醇對SAcc83細胞有明顯的促增殖和轉移作用。

2.2.5雞胚在其他生物醫學實驗中的應用雞胚還被用于其他研究中，如子宮內膜移位癥雞胚模型。Maas等[31]利用該模型研究了子宮內膜細胞的種植侵襲過程。俞超芹等[32]研究了葛根素對子宮內膜異位癥細胞惡性行為的調控機制，結果顯示葛根素能明顯抑制種植內膜囊泡及周邊血管形成，可以明顯上調EM在位基質細胞凋亡基因BAD、BAX、CASP8、CASP9和TNFRSF6的表達，并增強細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子CDKN1B、CDKN2A及IFNA1、IFNB1基因表達；減少癌基因FOS、CHEK2、SRC和黏附侵襲基因ITGB5、MMP9及生長、轉錄因子基因PDGFA、NFKBIA表達。為了探討氧化應激對胚胎發育的不良影響，研究疾病的發生機制，篩選和評價藥物活性，利用各種應激原負荷建立了不同的雞胚氧化應激模型[33]。也有學者利用雞胚背根神經節與前腦細胞體外培養來研究神經損傷修復與評價神經生長因子的作用和神經營養藥物的效果[34]。

3展望

如能充分利用雞胚的培養體系，則能為多領域的研究提供切實可行的方法與思路。目前神經細胞體外培養作為一種基本的實驗手段在神經生物學及細胞生物學界備受重視，借助神經細胞培養，不但可以了解神經元的形態發育過程，而且可探討細胞因子對神經元存活、生長的影響。但神經細胞是終末分化細胞，不能繼續增殖，對培養條件要求較高，技術要求嚴格，如能利用雞胚培養構建神經細胞的培養模型，則能為神經科學的教學與科研提供一種價格便宜，操作簡便，容易獲得，周期短的新方法與途徑。