生物醫(yī)學(xué)多光譜成像應(yīng)用

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1引言

研究生物體內(nèi)復(fù)雜的生物過程，最直觀的方法就是成像技術(shù)，如免疫組化、熒光原位雜交技術(shù)、細(xì)胞成像技術(shù)以及活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)等。由于自發(fā)熒光以及光譜重疊的干擾，這些成像方法都只能用一種染料標(biāo)記特定分子進(jìn)行成像，即便通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移來研究分子間的相互作用，也只能同時(shí)有兩種染料標(biāo)記，且無法消除光譜重疊的干擾。生物體內(nèi)過程的復(fù)雜性決定了單色成像用于生物醫(yī)學(xué)研究的局限性，特別是人類基因組計(jì)劃完成后，研究進(jìn)入后基因組時(shí)代，更加注重基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能信號(hào)通路的研究，這些核酸和蛋白質(zhì)復(fù)雜多樣，在體內(nèi)行使著多種多樣的功能，傳統(tǒng)的單色標(biāo)記成像已遠(yuǎn)不能滿足研究需求，而多光譜成像（multispectralimaging,MSI）技術(shù)，可以去除光譜重疊的干擾，同時(shí)標(biāo)記多個(gè)生物分子，對(duì)生物體內(nèi)復(fù)雜的物質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。近年來，隨著成像學(xué)和光譜學(xué)的發(fā)展，使得圖像被解混（unmixed）成為可能，多種染料標(biāo)記不同的生物分子，即使存在非常明顯的光譜重疊，通過光譜解混也能將每種光學(xué)信號(hào)彼此分離開來，MSI技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。本文就MSI技術(shù)的基本原理及其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用進(jìn)展做一綜述。

2MSI的基本原理

MSI技術(shù)是基于成像學(xué)和光譜學(xué)發(fā)展起來的一門新興技術(shù)[1]，它作為一種分析工具，可應(yīng)用于包括生物醫(yī)學(xué)在內(nèi)的很多不同的研究領(lǐng)域。多種熒光同時(shí)標(biāo)記時(shí)，經(jīng)過單色光的激發(fā)，其多種熒光信號(hào)混雜在一起，通過液晶可調(diào)諧濾光片（liquidcrys-taltunablefilter,LCTF）對(duì)所需波長光進(jìn)行濾過和電荷藕合元件（chargecoupleddevice,CCD）相機(jī)的采集，然后經(jīng)信號(hào)解混系統(tǒng)將采集到的多種混雜的光解混，經(jīng)過信號(hào)輸出和顯示，可直觀地觀察到不同顏色標(biāo)記的生物樣品的不同的成分或定位。MSI技術(shù)和普通成像技術(shù)的最大不同之處，能獲得每張圖像每個(gè)像素點(diǎn)的高分辨率的光譜，而不是肉眼所見的紅、藍(lán)、綠三色圖像。目前獲得光譜的方式主要可通過LCTF技術(shù)，LCTF是由一組連續(xù)的濾光片組成，它可以和CCD相機(jī)等設(shè)備很好地配合用于成像。LCTF通過對(duì)濾光片的連續(xù)調(diào)節(jié)，可允許很窄（10-20nm）帶通的光線通過相機(jī)，很快獲取不同波長的光譜數(shù)據(jù)，建立一個(gè)三維的“cube”。在這個(gè)“cube”里，每種光譜對(duì)應(yīng)每個(gè)像素點(diǎn)，然后在不同波長處檢測熒光探針或染料在細(xì)胞或組織中的分布，快速和精確地進(jìn)行光譜分類和分離，去除樣本的自發(fā)熒光，從而顯著地改善成像過程，并且同時(shí)適合于明視野和熒光的多靶點(diǎn)成像，具備完美的共定位分析功能而且通過計(jì)算純光譜方法學(xué)（computepurespectrum,CPS）定量更加準(zhǔn)確[2,3]。目前應(yīng)用較為廣泛的成像系統(tǒng)是美國劍橋CRi公司開發(fā)的MSI系統(tǒng)，該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖及產(chǎn)品。除了多光譜活體成像系統(tǒng)外，將多光譜成像原理和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合使用而開發(fā)出的ImageStream系統(tǒng)也引起廣泛關(guān)注。該系統(tǒng)整合了流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代方法學(xué)進(jìn)行成像分析，和流式細(xì)胞術(shù)相比，該系統(tǒng)可以基于熒光信號(hào)同時(shí)分析大量細(xì)胞的生物學(xué)特征并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，還提供了形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)[4]，如利用該系統(tǒng)可進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測[5]。

3MSI成像特點(diǎn)

組織的自發(fā)熒光限制了熒光染料在體內(nèi)成像的應(yīng)用，MSI技術(shù)的出現(xiàn)使得這一問題迎刃而解。在活體動(dòng)物中，動(dòng)物胃腸內(nèi)容物、皮膚等均有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，特別是當(dāng)激發(fā)光為藍(lán)色或是綠色時(shí)尤為明顯，通過利用近紅外發(fā)射波長的熒光染料，可以減少光的散射，吸收自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光仍然限制著成像的靈敏度，成像依然不理想。而通過MSI，可以消除自發(fā)熒光的影響[6]，使得其在多熒光標(biāo)記和混合標(biāo)記方面有很好的應(yīng)用。MSI技術(shù)可以適用于各種染料如傳統(tǒng)的熒光染料，明視野下的蘇木精、二氨基聯(lián)苯胺等。傳統(tǒng)的熒光染料如熒光蛋白，可以很好地用于MSI技術(shù)，熒光蛋白作為一種信號(hào)報(bào)告分子，它們可以示蹤細(xì)胞位移和亞細(xì)胞的生物過程，如基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[7]。近年來發(fā)展起來的新型熒光探針如量子點(diǎn)（quantumdots,QDs），以其良好的光學(xué)特性，尤其適用于MSI系統(tǒng)。QDs具有激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱、熒光強(qiáng)度高是羅丹明6G的20倍、光化學(xué)穩(wěn)定性好是羅丹明6G的100倍以上、耐光漂白、發(fā)射光顏色與粒徑大小關(guān)聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)，故選用粒徑大小不同的量子點(diǎn)，在同一激發(fā)波長下，不同的量子點(diǎn)將會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色，通過CCD相機(jī)捕捉，便可很理想地用于多光譜熒光分子成像[8]。

4生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

MSI技術(shù)的最新進(jìn)展已使實(shí)時(shí)表征、生物功能評(píng)定和手術(shù)中引導(dǎo)成為可能，包括在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用等相關(guān)方面。

4.1基礎(chǔ)研究

生物體內(nèi)蛋白種類繁多，且相互間作用關(guān)系復(fù)雜，MSI技術(shù)為我們提供了一種高效直觀的研究方法，該技術(shù)可以對(duì)生物組織內(nèi)的發(fā)色團(tuán)的空間分布進(jìn)行成像[9]，也可以同時(shí)進(jìn)行多種蛋白的體外成像研究，利用多種不同量子點(diǎn)標(biāo)記不同的蛋白用于蛋白印跡，具有更高的亮度和穩(wěn)定性[10]。本課題組最近利用MSI結(jié)合量子點(diǎn)免疫熒光技術(shù)檢測了肺癌組織中EMMPRIN和p53蛋白的共表達(dá)，乳腺癌組織內(nèi)Her-2和CK蛋白的共表達(dá)，結(jié)果表明：不論蛋白定位是否相同，解混后均能得到每個(gè)蛋白的表達(dá)信號(hào)，還可去除組織的自發(fā)熒光，提高了圖像的信噪比[11,12]。利用傳統(tǒng)熒光標(biāo)記，在同一激發(fā)波長下，MSI可以同時(shí)檢測福爾馬林固定石蠟包埋組織中三種不同的蛋白，不管是否有共定位，表明這種成像方法有利于在組織和細(xì)胞中完成多重分析[13]。除了單純的蛋白成像，MSI技術(shù)還能用于研究蛋白分子的折疊和結(jié)合過程[14]，進(jìn)一步拓寬了其應(yīng)用范圍。

4.2臨床應(yīng)用

多種成像技術(shù)已廣泛地在臨床上用于疾病的診斷，如核磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)（CT）、正電子發(fā)射體層攝影（PET）等，但這些成像系統(tǒng)價(jià)格昂貴，相比之下，MSI系統(tǒng)則更占優(yōu)勢，而且可以提高靈敏度和精確度，同時(shí)進(jìn)行多色標(biāo)記等，在疾病的診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。研究者們開發(fā)了一種內(nèi)窺鏡偏振光掃描光譜學(xué)（endoscopicpolarizedscanningspectroscopy,EPSS）系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)對(duì)整個(gè)食管表面的快速光譜掃描和多光譜成像，可以近實(shí)時(shí)地提供診斷[15]。EPSS通過掃描和成像可疑位點(diǎn)，指導(dǎo)組織活檢如癌前病變、非典型增生等是可行的。總結(jié)已發(fā)表的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)皮膚相關(guān)疾病和腫瘤的多光譜成像相關(guān)研究較為深入，本文主要從這兩方面來介紹該技術(shù)的應(yīng)用。

4.2.1皮膚疾病應(yīng)用研究

MSI技術(shù)由于其光譜穿透能力的限制，對(duì)深層組織的成像效果往往不佳，但對(duì)淺層組織特別是皮膚，其成像效果很理想，并可以通過人皮膚不同層次的斷面掃描，重建三維立體模型，且不受皮膚色素的影響[16]。2010年，Jakovels等[17]利用MSI技術(shù)在500-700nm光譜區(qū)間和500-600nm及530-620nm兩個(gè)子區(qū)間內(nèi)同時(shí)測定了皮膚的三個(gè)發(fā)色團(tuán)（chromophores）：氧合血紅蛋白、去氧血紅蛋白和黑色素，由于這三個(gè)發(fā)色團(tuán)的吸收光譜不同，故該技術(shù)可以明顯區(qū)分這三者。皮膚黑色素瘤的早期檢測對(duì)患者的生存至關(guān)重要，新形成的腫瘤的特點(diǎn)之一就是病變部位的血流量增加。實(shí)驗(yàn)證明500-700nm范圍內(nèi)的MSI成像具有高靈敏度和更高的反應(yīng)穩(wěn)定性，并得到了臨床試驗(yàn)的證實(shí)，基于該原理，也可以測定皮膚病變血管中氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的含量，來評(píng)估皮膚血管的血氧飽和度并估計(jì)血流量，從而有助于黑色素瘤的早期診斷[18]。MSI系統(tǒng)還可以與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行整合獲得重構(gòu)的高光譜cube，用于皮膚病變的體內(nèi)成像，結(jié)果表明高光譜cube可提供皮膚光反射的光譜數(shù)據(jù)以及二維空間信息，這有助于改善從皮膚癌到炎癥疾病的診斷和隨訪[19]。皮膚損傷是全球很普遍和治療成本較高的疾病，并且其病因和愈合過程具有多因素性和復(fù)雜性。由于測量傷口大小和其他相關(guān)特征具有主觀性，創(chuàng)傷愈合的定量評(píng)價(jià)難以開展，而利用MSI技術(shù)可以很好地解決這一問題[20]。Basiri等[20]人設(shè)計(jì)了一種新型的多光譜相機(jī)，這種相機(jī)可以在單一的快照中獲得18種不同波長的圖像，通過相機(jī)與濾鏡的有機(jī)結(jié)合，將這一技術(shù)應(yīng)用于皮膚發(fā)色團(tuán)的表征。為了評(píng)價(jià)皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)的生物工程成分———聚羧甲基葡萄糖酸鹽（polycarboxymethylglu-cosesulfate,PCMGS）在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中是否有促進(jìn)作用，他們利用MSI技術(shù)來量化皮膚氧飽和度及其和傷口愈合之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，傷口大小均逐漸減小，O2含量逐漸下降，證明O2在創(chuàng)傷愈合過程中起著重要作用。

4.2.2腫瘤應(yīng)用研究

腫瘤現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，且其發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢。應(yīng)用成像技術(shù)進(jìn)行腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等研究具有直觀便捷等優(yōu)點(diǎn)，但由于腫瘤生物學(xué)過程的復(fù)雜性，單色成像遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足腫瘤研究的需求。MSI技術(shù)出現(xiàn)后，在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用更為廣泛。Song等[21]第一次用單抗偶聯(lián)的熒光磁性靶向多功能納米生物探針進(jìn)行多種細(xì)胞的檢測和分離。利用這種MSI成像技術(shù)，他們成功地從多種混合細(xì)胞中檢測和分離出了白血病細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，并且這種分離效果可以達(dá)到96%以上。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合特異性單抗，可以進(jìn)行腫瘤的早期診斷，這種方法不但簡單、敏感、有效、快速并且成本低。在臨床上，這種非侵襲性的MSI技術(shù)是一種很好的方法，可以用于腫瘤如前列腺癌的活檢、放療、外科手術(shù)定位及對(duì)腫瘤的病程監(jiān)測，以彌補(bǔ)單色成像的不足[22]。Gilbert等[23]應(yīng)用MSI在膀胱小塊活檢組織中同時(shí)檢測CK20和p53蛋白的共表達(dá)，根據(jù)蛋白表達(dá)水平，可區(qū)分腫瘤性尿路上皮、良性或反應(yīng)性尿路上皮。Roblyer等[24]利用多光譜寬視野光學(xué)成像可早期檢測口腔腫瘤，該技術(shù)可以精確鑒別腫瘤組織和非腫瘤組織，但其不能區(qū)分癌前病變和癌組織。在腫瘤局部區(qū)域治療中，精確的腫瘤切除是很重要的。手術(shù)中采用多光譜熒光成像結(jié)合傳統(tǒng)的成像方法如x-線、MRI、SPECT/CT和超聲有利于腫瘤切緣的精確決定[25]。Noonan等[26]將MSI系統(tǒng)和關(guān)節(jié)機(jī)器人內(nèi)窺鏡聯(lián)合用于腫瘤細(xì)胞的邊緣鑒定和定位，這將使腫瘤的定位更準(zhǔn)確，極大地有利于腫瘤手術(shù)切除，特別是那些難以診斷和定位的腫瘤。Chin等[8]報(bào)道應(yīng)用基于雙發(fā)射量子點(diǎn)的多光譜術(shù)中熒光實(shí)時(shí)成像可指導(dǎo)外科手術(shù)的切除。前哨淋巴結(jié)（sentinellymphnode,SLN）是腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)最先受累的一個(gè)或一組淋巴結(jié)。在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，如果SLN內(nèi)無腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，則下游淋巴結(jié)也不會(huì)有轉(zhuǎn)移，故SLN內(nèi)腫瘤細(xì)胞的存在與否可以證明腫瘤是否通過淋巴道轉(zhuǎn)移，MSI技術(shù)也廣泛應(yīng)用于該領(lǐng)域研究。Crane等[27]在10個(gè)早期子宮頸癌病人手術(shù)過程中將專利藍(lán)和吲哚菁綠混合物注入子宮頸內(nèi)，然后通過多光譜熒光攝像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄，6個(gè)病人淋巴道檢測到了熒光信號(hào)，共檢測了9個(gè)SLNs，其中一個(gè)有腫瘤轉(zhuǎn)移。這表明將MSI用于檢測子宮頸癌的SLN轉(zhuǎn)移是可行的，但考慮到靈敏度和特異性，這種方法需要進(jìn)一步改進(jìn)。同年他們小組還用相同的方法成功地對(duì)陰道和卵巢癌的SLN進(jìn)行成像[28]。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，這種技術(shù)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)，將其用于指導(dǎo)手術(shù)，不需要使用放射性膠體，可保護(hù)病人隱私減輕病人心里痛苦。

4.3其它應(yīng)用

MSI系統(tǒng)以其優(yōu)良性能為科研工作者帶來了極大地便利。到目前為止，除了皮膚和腫瘤相關(guān)研究，該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的其它各個(gè)方面。Rouse等[29]在白天光照條件下利用實(shí)時(shí)監(jiān)測成像系統(tǒng)檢測植被反射時(shí)CO2進(jìn)入大氣的含量。Weber等[30]將CT成像和多頻空間頻率域成像（SFDI）聯(lián)用進(jìn)行MSI檢測小鼠腦損傷，提高了圖像獲取性能。Hight等[31]用多光譜熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞外pH測定，并評(píng)價(jià)了該系統(tǒng)用于結(jié)直腸癌細(xì)胞異體移植的高分辨率pH測定的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Kulesa等[32]利用多光譜指紋印跡技術(shù)，通過多色細(xì)胞標(biāo)記和多光譜共聚焦成像方法對(duì)位置隨時(shí)間不斷變化的胚胎細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)時(shí)跟蹤，解決了胚胎細(xì)胞示蹤困難的問題。Luckl等[33]通過MSI監(jiān)測局部腦缺血來闡明對(duì)側(cè)前爪刺激產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。除此之外，近三年來，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，這項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的方方面面都得到了廣泛地應(yīng)用，如視網(wǎng)膜成像[34]，Tourette綜合癥中大腦形態(tài)測量[35]，嗜酸性食管炎的定位[36]，大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成像[37]等。雖然MSI技術(shù)應(yīng)用日趨廣泛，不得不注意到的是由于熒光散射和吸收導(dǎo)致的其熒光信號(hào)的低穿透能力，這也是其廣泛應(yīng)用于皮膚相關(guān)研究而較少用于體內(nèi)深部組織研究的原因，即便是應(yīng)用性能優(yōu)良的新型染料如量子點(diǎn)，也只能穿透十幾毫米而已[8]，因此研究者們渴望開發(fā)出熒光強(qiáng)度更高性能更好的熒光染料。

5結(jié)語和展望

近年來，MSI技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已日趨廣泛和深入，大大地推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特別是在改進(jìn)疾病檢測或鑒別和術(shù)內(nèi)轉(zhuǎn)移診斷的精確性，指導(dǎo)神經(jīng)外科并能監(jiān)控治療反應(yīng)等方面的應(yīng)用[38]。MSI技術(shù)以直觀的方式展現(xiàn)了生物體內(nèi)的復(fù)雜過程，雖也有些不足之處，但也難以掩蓋它與其它成像技術(shù)相比的獨(dú)特優(yōu)越性，隨著新型熒光染料如量子點(diǎn)的不斷發(fā)展，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用也必將更加廣泛！