分子生物學技術在昆蟲生態學中的應用

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摘要：昆蟲分子生態學是一門交叉學科，利用現代分子生物學技術研究和解釋昆蟲生態學的問題。在昆蟲分子生態學研究中應用較多的分子生物學標記技術有：同工酶（蛋白質電泳）方法、限制性片段長度多態性（RFLP）方法、隨機擴增DNA多態性（PAPD）方法、擴增片段長度多態性(AFLP)及微衛星標記方法（SSR）及單核苷酸多態性(SNP)。

關鍵詞：分子生物學；技術；昆蟲生態學

分子生態學是應用分子進化和群體遺傳學的理論、分子生物學的技術手段、系統發生學和數學的分析方法及其他學科的知識（如地理學、古氣候學等）去研究種群、進化、生態、行為、分類、生物地理演化、生物保護等學科領域的各種問題。它主要通過大量使用分子生物學先進的技術和方法，在分子水平上研究生態現象，闡明生態現象的分子機制。昆蟲分子生態學就是以昆蟲作為研究對象，應用分子生態學的原理與方法研究昆蟲進化和適應機制的一門科學。它主要通過分子生物學的方法檢查昆蟲種群或個體的遺傳變異，分析和解釋遺傳變異的特點與規律，揭示遺傳變異所反應的規律性的東西，從而進一步闡明昆蟲之間一級昆蟲與環境之間的相互作用關系。其研究的最典型特色是運用分子遺傳標記來檢測研究對象的遺傳變異特征，揭示昆蟲的演化規律。在昆蟲分子生態學研究中應用較多的分子生物學標記技術有：同工酶（蛋白質電泳）方法、限制性片段長度多態性（RFLP）方法、隨機擴增DNA多態性（RAPD）方法、擴增片段長度多態性（AFLP）及微衛星標記方法（SSR）及單核苷酸多態性(SNP)。其中，目前應用最多，最簡便的是SSR和SNP技術。下面我們主要介紹在昆蟲生態學研究中幾種常用分子標記方法。

1.同工酶方法的應用

同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子結構不同的一類酶。自從Hunter和Markert創立同工酶酶譜技術后，同工酶譜的變化即可作為鑒定物種、研究分類與進化、遺傳與變異的重要指標。在昆蟲分子生態學發展之初，同工酶被廣泛應用與昆蟲的分類、種群間抗性的遺傳變異等方面，隨著分子生物學技術的廣泛應用，同工酶技術已慢慢被淘汰。

2.RFLP技術的應用

RFLP又叫作RestrictionFragmentLengthPolymorphism.即我們所說的限制性內切酶片段長度多態性，而且他作為第一代的生物分子類標記技術，這種技術是指通過已經發現的限制性內切酶來處理不同生物個體的DNA，通過利用限制性內切酶的多種特異性來達到獲得不同的DN段的目的，這種技術一般是被應用于分子雜交，放射性同位素的顯微技術中，而且也只是主要用于研究生物遺傳的研究中，自問世以來已廣泛運用于多門生物學科研究中。在昆蟲生態學研究中可以用于昆蟲遺傳譜圖的分析、遺傳連鎖圖的構建及數量遺傳性狀等方面的研究。

3.RAPD技術的應用

RAPD，俗名是隨機擴增多態性DNA技術，它是由兩位美國科學家Wiliams和Welsh在1990年提出的，而且他們并不是研究的合作者，而是分開研究的，這種技術又被稱作任意引物PCR。對于RAPD來說，它所使用的物質是十分不相同的，但是對于現存的所有引發物來說，他對于在DNA序列堿基序列上的特定結合位點來說，一旦這些特異性DNA位點達到了基因組分布的擴增條件，他就會根據DNA堿基對的配位原則，完成DNA另一條鏈的合成。

4.AFLP技術的應用

植物基因組的AFLP中的酶切，連接和pcr問題，只要酶切出來能看到些許彌散，pcr就應該能看出結果才對，AFLP技術的關鍵就是把握體系的問題，每一個實驗室應該有自己的一套體系，照著做一般沒有問題，分子標記，就是純體力勞動，做得很多一般就會有結果的，這是量變到質變的過程。做AFLP需要用到試劑盒，但試劑盒不如自己做省事，也沒必要。除非你做的量少。但是分子標記要的就是大量重復性的勞動。因此，試劑盒不如自己做省事，也沒必要，并且試劑盒中很重要的酶往往量不夠用，比如T4連接酶和內切酶EcoRI，除非你做的量很少，且不需要摸索體系。酶切出來能看到些許彌散，pcr就應該能看出結果，也不一定。接頭制作和連接體系也很重要，連接時間一般影響不是很大。

5.微衛星標記技術在昆蟲生態學研究中的應用

微衛星標記ms是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序串聯重復而成的DNA序列,其長度一般較短,廣泛分布于基因組的不同位置,如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復。自1981年Spritz首先在珠蛋白中發現微衛星序列到今天微衛星序列在生物學中的廣泛應用,微衛星標記技術走過了近30多年的發展變化。其中，20世紀80、90年代是微衛星技術從開始到逐漸成熟的關鍵階段。1982年Hamada等在研究真核生物基因組中Z-DNA形成時發現了一種新的重復因素——選擇性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys等通過對小衛星(minisatellite)的DNA指紋圖譜鑒定證明了串聯重復的DNA具有很高的長度差異性。與此同時，Tautz等的研究表明，這種“神秘而簡單冶的DNA序列是遺傳變異的重要來源。1989年Tautz首次應用了基于PCR的微衛星分型技術。隨著微衛星分子標記的廣泛使用，科研工作者對其進化、功能及在基因組中的分布等研究的了解迅速增加。近年來，微衛星分子標記也被廣泛應用于昆蟲學研究的各個領域。截至2012年6月，共有16396個昆蟲上微衛星位點在NCBI中記錄，其中雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲的微衛星登錄數量最多，占75%。這些微衛星被廣泛應用于昆蟲遺傳作圖、種群遺傳學研究、個體親緣關系鑒定等方面。

6.SNP在昆蟲分子生態學中的應用

SNP(SingleNucleotidePolymorphism)即單核苷酸多態性標記，又稱單核苷酸多態性，指DNA序列中單個堿基的差別，堿基對由于排列方式不同，結合不同脫氧核苷酸對，這些核苷酸對構成密碼子，密碼子則以不同的排列順序編碼蛋白質，從而形成自然界多種多樣的生命。SNP在基因組可以劃分為兩種形式：一是基因編碼區的功能性突變，主要分布在基因編碼區，故又稱為cSNP，這類SNP較少，其變異率僅占周圍序列的1/5，但因其在遺傳疾病研究中具有重要意義而備受關注；二是遍布于基因組的大量堿基變異。就現在來說，SNP技術已經開始廣泛用于昆蟲分子生態學，包括昆蟲種間鑒定，遺傳圖譜的分析、入侵害蟲種群間親緣關系的區分等研究。生態學的發展，SNP技術的萌芽是古人生態意識的總和，在古時，古人并不了解整個自然界，但是他們通過長期的打魚，農牧以及狩獵積累了大量的樸素的生態學知識，比如說農作物的生長與季候的關系、常見的動物有哪些習性等等，在公園前四世紀時，希臘學者亞里士多德就曾經粗略的描述了動物有種不同的棲息地，還根據動物生活棲息地的特點將其分為了水棲和路棲，根據它的食性分成肉食和草食，還有雜食動物等等。隨著人類社會的發展，人們對于生態的認識不再僅僅局限于以往的知識積累，人們通過自己的主動探究從而能夠獲得有關于自然界的種種知識，最后能夠形成一個全面的生態學理念極其生態學系統的認知應用。本文通過描述幾種技術在昆蟲生態系統的運用從而得到現在科技在生態系統中的應用等等相關關系，這種應用不僅使各種技術得到提高，還對我們生態系統的探索起著極大的作用。

參考文獻

[1]郭曉霞，鄭哲民，于廣志.同工酶在昆蟲分類和進化研究中的意義[J].昆蟲知識，2000，37（6）：371-374.

[2]陳輝.RFLP和RAPD遺傳標記技術及其在昆蟲學中的應用[J].陜西林業科技，1999（1）:49-52.

作者:汪霖 邵筠喬 單位:鞍山出入境檢驗檢疫局 遼寧出入境檢驗檢疫局