分子生物學(xué)檢測食品微生物技術(shù)

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摘要:21世紀(jì)，世界上的各類科學(xué)技術(shù)和專業(yè)學(xué)科都有了長足的發(fā)展和進(jìn)步，比如說生物化學(xué)學(xué)科、免疫學(xué)學(xué)科等，其中作為代表性研究項(xiàng)目的分子生物學(xué)得到了越來越多人的關(guān)注，隨著現(xiàn)代化設(shè)施的更新和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)的相關(guān)研究成果被大量運(yùn)用在人們生活中，促使了社會的長久進(jìn)步。

關(guān)鍵詞:分子生物學(xué)；食品；微生物

1分子生物學(xué)的概念闡述

分子生物學(xué)作為一種基礎(chǔ)性學(xué)科，將分子作為一種物質(zhì)來研究生命的相關(guān)現(xiàn)象，比如構(gòu)成細(xì)胞的物質(zhì)，能夠發(fā)生何種物理和化學(xué)變化。在進(jìn)行探究的過程中，這種學(xué)科代表了人們由探究生命的出現(xiàn)和進(jìn)化，可以得到生命所表達(dá)的重要意義。

2分子生物學(xué)在食品微生物檢測中的應(yīng)用意義

分子生物學(xué)的各項(xiàng)研究成果已經(jīng)滲透進(jìn)了人們的實(shí)際生活中，而且起到了促進(jìn)社會發(fā)展，和為全世界解決實(shí)際問題的作用。比如將酶催化產(chǎn)生的反應(yīng)和原因運(yùn)用到各類化學(xué)工業(yè)活動中，人工進(jìn)行酶的模擬并生成新的催化劑，不僅能針對性地解決問題，還可以在化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)新的革命。除了在化學(xué)方面有所益處，對食品安全方面也有巨大意義，它能夠更新微生物檢測技術(shù)，提升了食品安全，保障了食品加工過程中產(chǎn)品的質(zhì)量和人的健康。

3基于分子生物學(xué)方法的食品微生物檢測技術(shù)研究

3.1以電泳為主導(dǎo)技術(shù)的DNA圖譜技術(shù)

由于排列順序不同的DN段會在變性劑濃度不同的情況下發(fā)生改變，利用不一樣的解鏈行為，使排列順序不同的DN段會停留在不同位置的凝膠上這一特性，提出了DGGE技術(shù)來檢測核酸序列，在被變性劑染色成功后，會在凝膠的各個(gè)位置上出現(xiàn)條帶狀物體。這種技術(shù)已經(jīng)被越來越多相關(guān)企業(yè)運(yùn)用，進(jìn)行食品微生物的抽離或測定，檢測微生物的數(shù)量等。J.Theunissen和T.J.Britz等人2004年在南非對含益生菌對食物進(jìn)行了DGGE技術(shù)檢測[6];MilicaNikolic等人則在南非自制的山羊奶干酪中進(jìn)行了PCR-DGGE檢測。在DGGE之后出現(xiàn)的NA指紋圖譜技術(shù)，也叫做溫度梯度凝膠電泳，不同于DGGE的凝膠中使用尿素和甲酰胺濃度梯度的方法，溫度梯度凝膠電泳使用了溫度梯度和在引物的5′端增加3050bpGC片段的新技術(shù)。這種新的方式可以有效地統(tǒng)計(jì)出某一區(qū)塊內(nèi)，微生物的數(shù)量和品種，還可以檢測出其他未知的腸道細(xì)菌，雖然Zoetendal等人已將這項(xiàng)TGGE技術(shù)運(yùn)用在了人糞樣微生物的探究分析中，但是針對食品的運(yùn)用還很少。

4隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)(RAPD)

通過將隨機(jī)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并加重靶細(xì)胞DNA的比例進(jìn)行分析，這一方法被稱為RAPD分析，它能夠讓研究人員了解DN段的大小和數(shù)量，再根據(jù)DNA在不同基因組中的差異做出判斷。這種方式能夠?qū)⑷緿NA基因定位成目標(biāo)對象，可以辨識極小的差別，非常適合運(yùn)用在研究成果少，特點(diǎn)不明顯的或是DNA序列不凸顯的真菌和乳酸菌的研究中。G.Spano等人利用RAPD-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了隱藏在紅葡萄酒中的植物乳桿菌，Walczak等人利用RAPD分析法得出了非生產(chǎn)用酵母菌株與標(biāo)準(zhǔn)清酒假絲酵母菌株具有相近的遺傳特質(zhì)。此外，針對葡萄球菌、大腸埃希氏、沙門氏菌和志賀氏菌等研究，都采用了這種技術(shù)方法。

5基因探針檢測方法

1968年，華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Britten等人研究提出了核酸分子雜交技術(shù)，也叫做基因探針技術(shù)，這種技術(shù)的提出為分子生物學(xué)的DNA分析方法奠定了基礎(chǔ)，也成為了全球范圍內(nèi)被使用最多的分子生物學(xué)技術(shù)。基因探針是一種具有特定標(biāo)記的基因碎片，具有檢測功能的原理是采用了堿基的配對，通過退火讓兩條互補(bǔ)的核酸單鏈成為雙鏈。這種檢測技術(shù)可以用來檢測食品微生物，具有方便快捷，直接有效的特點(diǎn)，使食物免遭致病性微生物的損害。病原體其本身具有特殊的核酸碎片，利用已經(jīng)做好分離和標(biāo)志的核酸探針，將與需要檢測的樣品結(jié)合過的標(biāo)記物進(jìn)行監(jiān)測，如果檢測的樣品中本身就有確定的病原體，那么探針和核酸序列就會有所結(jié)合。這種基因探針檢測技術(shù)的優(yōu)勢在于，能夠非常靈敏地檢測出不同，而且還具備了組織化學(xué)染色的特點(diǎn)，即可被見的特性和可定位的特點(diǎn)，所以能夠檢測出食品中的致病性細(xì)菌。就現(xiàn)在來說，世界各地都提出了各種能夠檢測食品微生物的基因探針，比如說Moseley等人提出的生物素標(biāo)記的沙門菌基因探針，以及Kerdahi等人提出的能夠測試出單核細(xì)胞增生的李斯特菌的，來自非放射性DNA探針，還有陳倩等人能夠檢測出ESIEC大腸桿菌的，根據(jù)HPI毒力島基因生成的rp－z探針。另外還有已轉(zhuǎn)變?yōu)樘厥馍唐返幕蛱结樤噭┖小Ｃ绹腉ENETRAK公司采用特殊的基因探針對沙門菌、李斯特菌和大腸桿菌的rRNA進(jìn)行檢驗(yàn)[6]，最后得出了脫氧核糖核酸雜交篩選比色法。主要檢驗(yàn)方式分為以下幾步:

(1)需要一種與細(xì)菌rRNA相反的基因探針和一份完成增菌培養(yǎng)的樣品，細(xì)菌溶解之后與帶有熒光素標(biāo)記的探針互相雜交。此時(shí)樣品中存在靶細(xì)菌rRNA，則帶有熒光素和多聚脫氧腺嘌呤核苷酸(polydA)的探針互相雜交將成立。

(2)將包被多聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(polydT)的固相載體測桿與雜交溶液反應(yīng)，如果polydA和polydT間的堿基出現(xiàn)配對，那么雜交核酸分子就被固體載體獲得，并將這種分子培養(yǎng)在辣根過氧化酶－抗熒光素接合劑中，使探針上的熒光素與結(jié)合劑溶合。

(3)固體載體首先放置在酶底物－色原溶液，再由辣根過氧化酶與底物反應(yīng)，最后用酸終止，在450nm處計(jì)量吸光度的多少，就能確定樣品中是否存在靶細(xì)菌。

6基因芯片

上世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)的基因芯片技術(shù)，也就是DNA微陣列(DNAmicroarray)，使用微加工技術(shù)構(gòu)建出能將人工產(chǎn)生的基因片段，緊密結(jié)合的、排列有序的出現(xiàn)在硅片等載體上。再根據(jù)被熒光檢測系統(tǒng)掃描過的，和標(biāo)記樣品雜交后的芯片，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析檢測，得出定性、定量的結(jié)果。由于基因芯片技術(shù)能夠高度地自動處理大量信息，所以能夠快捷準(zhǔn)確地檢測食品安全。運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行病原體檢測的有:Berger等人進(jìn)行的12株嗜酸乳桿菌檢測;Wang等人進(jìn)行能夠具有超強(qiáng)特異性和靈敏度的肺炎鏈球菌檢測;高興等人對痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、肉毒梭菌、肺炎鏈球菌、布氏桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌等16種病原細(xì)菌進(jìn)行檢測。但就目前的技術(shù)來說，基因芯片的應(yīng)用還不夠完善，首先，基因芯片所需的設(shè)備價(jià)格不低，制作成本很高，普通實(shí)驗(yàn)室沒有足夠的經(jīng)濟(jì)能力可以負(fù)擔(dān)。其次，基因芯片的特異性還不夠明顯，假陽性和假陰性會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)程度產(chǎn)生影響。最后，基因芯片技術(shù)在進(jìn)行過程中，各項(xiàng)數(shù)據(jù)和參數(shù)還沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對可重復(fù)性會產(chǎn)生影響。只有不斷完善自身解決上述問題，基因芯片技術(shù)才能被更廣泛地運(yùn)用在全世界的各個(gè)領(lǐng)域。伴隨著全球食品貿(mào)易的發(fā)展，檢測食品病原菌也越來越重要，只有更方便快捷地完成食品安全檢測，將分子生物學(xué)的檢測方法運(yùn)用于日常生活，才能更好地發(fā)揮這項(xiàng)學(xué)科的魅力，研究出真正實(shí)用的食品病原微生物快速檢測方法。

參考文獻(xiàn)

[5]陳倩,程伯琨.基因探針檢測食品中具有HPI毒力島的ESIEC大腸桿菌[J].食品科學(xué),2000,21(7):35．

[6]王晶,王林,黃曉容.食品安全快速檢測技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:120-160．

作者:黃卉 單位:肇慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校