柚苷酶應用下食品工業(yè)論文

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1柚苷酶酶活測定方法

1.1Davis紫外分光光度計法

現(xiàn)在多采用改良后的Davis測酶活方法，該種方法也是測定酶活應用最多的一種。但缺點是后期紫外分光光度計時會受到底物顏色的限制，柚皮苷為黃色溶液，可能影響柚皮苷含量的測定，進而使測定的酶活不準確，并且僅是對底物柚皮苷的含量測定來獲得柚苷酶的酶活力大小，無法知道組成該酶的其他酶α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力情況。

1.2高效液相色譜儀測定柚皮苷含量

用高效液相色譜來測定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不僅可以測定柚苷酶的酶活力，同時還可以測得α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活測定精確具體化，檢測柚皮苷的精確度高，誤差小，提高了結果的準確性，但是操作較前一種Davis法繁瑣，時間延長。對于不同的柚苷酶，高效液相色譜法檢測分析的實驗條件不同。陳月龍在其論文中采用高效液相色譜測定酶活時的流動相選取的是甲醇、水、乙腈并采用不同梯度洗脫分離柚苷酶水解后的產(chǎn)物，從其結果中可看出實現(xiàn)了柚皮苷、柚皮素與普魯寧的完全分離。鄧媛等也采用高效液相色譜對柚苷酶活力以及普魯寧酶活力進行測定，同時進行了酶促動力學研究，得出柚苷酶酶解的最佳條件。高效液相色譜法測定柚皮苷含量的優(yōu)點是直接反映酶解作用的各種產(chǎn)物含量，可獲得該酶所包含的各種酶的酶活力大小，方法準確直觀，直接測得不同酶活力大小，缺點是操作較復雜。

2微生物來源柚苷酶的制備

2.1柚苷酶產(chǎn)生菌株的篩選

有效的微生物篩選方法可以大量節(jié)約菌株篩選的時間和成本，因此在篩選柚苷酶產(chǎn)生微生物的過程中選擇合適的篩選方法至關重要。目前微生物的篩選方法有透明圈法、高層試管法以及定性濾紙顯色法，其中高層試管法和定性濾紙法誤差較大，相較而言，透明圈法操作簡單，觀察方便，適用于定性篩選，是目前應用較為廣泛的一種篩選微生物方法。

2.1.1透明圈法透明圈法是指微生物分解平板培養(yǎng)基中溶解性較差的底物，使菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應該菌株利用底物的能力。盧建明等人研究發(fā)現(xiàn)將菌懸液涂布于長有菌落的培養(yǎng)基內(nèi)，能分解柚皮苷產(chǎn)柚苷酶的菌落在四周就會出現(xiàn)一圈肉眼可見的透明圈，但是該種方法存在誤差并不能有效判斷菌株產(chǎn)柚苷酶狀況。陳玲等改良了柚苷酶平板透明圈篩選模型，利用硫酸二乙酯（DES）能與培養(yǎng)基中未分解的底物柚苷發(fā)生黃色反應這一原理，加入一定比例的硫酸二乙酯（DES）混合液，反應后菌落周圍出現(xiàn)了肉眼清晰可見的透明圈。這種方法加大了透明層與外圍未分解培養(yǎng)基的顏色對比，便于觀察和測量透明圈的大小，簡化了檢測步驟，提高了菌種篩選效率，是目前應用最為廣泛的一種柚苷酶產(chǎn)生菌株的篩選方法。

2.1.2高層試管法高層試管法的原理是通過菌體在試管培養(yǎng)基中產(chǎn)酶并逐漸擴散開，分解培養(yǎng)基中所含柚皮苷產(chǎn)生的透明層來判斷菌株的產(chǎn)酶能力大小，但是此方法也不易觀察區(qū)分開透明層的界限使判斷有誤差。3.1.3定性濾紙顯色法定性濾紙顯色法是利用柚皮苷水解后不顯色來區(qū)分產(chǎn)不產(chǎn)生柚苷酶分解柚皮苷，柚皮苷在培養(yǎng)基中既作為產(chǎn)酶的誘導物，又作為酶的底物在顯色時作指示劑，一次性加入簡化了分析的操作步驟。但是文獻中采用較少，目前應用最多的仍為透明圈法，有待開發(fā)出新的高效篩選產(chǎn)柚苷酶微生物的方法。

2.2柚苷酶產(chǎn)生菌株的改良

通過傳統(tǒng)篩選方法從自然環(huán)境中篩選的野生菌株的產(chǎn)酶能力一般不高，且篩選方法工作量大，效率低。因此有必要運用現(xiàn)代生物技術（如原生質(zhì)體誘變育種、基因工程育種等）對天然菌株進行改良獲得柚苷酶高產(chǎn)菌株，以便得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的菌株，使得在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用。其中原生質(zhì)體誘變育種包括物理誘變與化學誘變。

2.2.1物理誘變物理誘變育種技術目前已成為工業(yè)上微生物育種中最為常用和最有效的技術之一，對微生物誘變效果比較好而且應用廣泛的主要有紫外線、x射線、射線和快中子等。以上誘變技術所用的設備簡單、操作方便，利用這些誘變源進行單一或者復合誘變已經(jīng)得到大量的高產(chǎn)工業(yè)微生物菌株，在工業(yè)微生物的誘變中發(fā)揮著重要的作用。陳玲等采用不同的紫外線照射時間對產(chǎn)酶菌株孢子進行誘變處理，得到1株搖瓶發(fā)酵單位為500U/mL的菌株，比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了近30%。物理誘變方法并不是單一因素誘變，可選擇多種誘變方式復合，以獲得更優(yōu)良的產(chǎn)柚苷酶菌株。

2.2.2化學誘變化學誘變的優(yōu)點是經(jīng)濟方便（只需少量的藥劑和簡單的設備）、具有一定的專一性，應用廣泛。陳玲等用亞硝基胍（NTG）對柚苷酶生產(chǎn)菌出發(fā)菌株孢子進行誘變處理，得到1株搖瓶發(fā)酵單位達770.06U/mL的菌株，比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了近100%。汪釗等用硫酸二乙酯（DES）處理產(chǎn)柚苷酶菌株，正變率高達50%。

2.2.3基因重組技術基因重組技術即是將目的基因通過基因工程技術導入到受體細胞中并表達，目前已有關于α-L-鼠李糖苷酶通過埃希氏大腸桿菌克隆和表達的相關報道，Miyata將Sphingomonaspaucimobilis菌株中編碼rhaM的基因進行克隆，于E.coli中成功表達，Birgisson等人從新型嗜熱細菌中克隆出兩種熱穩(wěn)定性的α-L-鼠李糖苷酶基因，分別為rhmA和rhmB，并在大腸桿菌中表達，Hashimoto等從Bacillussp.中獲得rhaA和rhaB兩種α-L-鼠李糖苷酶，轉(zhuǎn)入大腸桿菌克隆表達。α-L-鼠李糖苷酶基因重組技術使得柚苷酶更易獲得且更經(jīng)濟，在食品工業(yè)和制藥工業(yè)將獲得更大的用途。但由于柚苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成，并不是單一的酶系，所以使得產(chǎn)柚苷酶微生物的基因工程育種難度較大，必須對兩種酶的結構性質(zhì)深入研究，掌握兩種酶在應用中的相互關系，才可能構建基因工程菌直接發(fā)酵生產(chǎn)出柚苷酶。

2.3柚苷酶的發(fā)酵制備

柚苷酶的發(fā)酵制備方法主要是固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法。固態(tài)發(fā)酵是指在沒有或幾乎沒有自由水存在情況下，在具有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，進行一種或多種微生物發(fā)酵的工藝過程。相比于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵時間更短。

2.3.1固態(tài)發(fā)酵研究1996年汪釗對黑曲霉ZG86進行柚苷酶固體發(fā)酵研究，得出結論當發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量為52%～65%時，可以更好的地促進菌體合成柚苷酶，使發(fā)酵周期從115h縮短至60h左右，大大減少了發(fā)酵時間，產(chǎn)酶活力可達15000U/g豆餅粉。Elinbaum等人研究了土曲霉CECT2663生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)柚皮苷比鼠李糖更加適合作為生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的誘導物，同時證實了固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵時間更短。固態(tài)發(fā)酵設備投資成本較少，能源消耗低，使其對環(huán)境的污染少，并且技術簡單容易操作，再加上培養(yǎng)基的來源廣價格低使固態(tài)發(fā)酵法在生產(chǎn)柚苷酶方面應用范圍廣，它具備自動控制能力，但缺點是得到的酶活性較低，后期分離純化困難。

2.3.2液態(tài)發(fā)酵研究液體發(fā)酵法是是目前工業(yè)生產(chǎn)柚苷酶的主要發(fā)酵方式，指的是發(fā)酵用培養(yǎng)基呈液態(tài)的微生物培養(yǎng)過程，整個發(fā)酵過程自動化程度高，不易收到污染，得到的柚苷酶在后期純化過程較固態(tài)發(fā)酵法容易，液態(tài)發(fā)酵法可分為液體表面發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法，其中液體深層發(fā)酵法是目前發(fā)酵工業(yè)中普遍使用的一種方法。隨著基因工程技術的飛速發(fā)展以及用于發(fā)酵生產(chǎn)設備的快速改進，使得以液體發(fā)酵法生產(chǎn)商品酶制劑的成本正在逐步下降，因此更加有利于柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3.3發(fā)酵罐高效密度發(fā)酵目前柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)技術的不成熟和制劑化工藝的缺乏，導致成品柚苷酶酶制劑價格高昂，這嚴重限制了柚苷酶應用技術的開發(fā)，因此建立成熟的柚苷酶規(guī)?；l(fā)酵技術和合理的制劑化工藝具有重要意義。發(fā)酵罐高效密度發(fā)酵是將每一種成熟的發(fā)酵產(chǎn)品從實驗室研究走向工業(yè)化生產(chǎn)應用的必經(jīng)之路的方法。丁濤等人的論文中柚苷酶以200L規(guī)模的發(fā)酵放大，并研究發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)酵規(guī)模中，α-L-鼠李糖苷酶活力出現(xiàn)最大值的發(fā)酵時間表現(xiàn)出有所不同的現(xiàn)象，并且最高α-L-鼠李糖苷酶活力可達1091U/mL。目前關于柚苷酶液態(tài)發(fā)酵的研究主要為一些小規(guī)模范圍，如搖瓶發(fā)酵和10L發(fā)酵罐的研究，涉及到柚苷酶發(fā)酵規(guī)模系統(tǒng)性放大的研究還報道還較少，有待進一步的研究與開發(fā)。

3柚苷酶在食品工業(yè)中的應用

柚苷酶能將柚皮苷分解成無苦味物質(zhì)，故在果汁的脫苦方面起到關鍵酶的作用，對于柑桔加工業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義，社會對柚苷酶的需求越來越大，但目前柚苷酶的主要生產(chǎn)途徑卻面臨著微生物發(fā)酵效率低、成本偏高等問題。同時由于高產(chǎn)菌株的缺乏，國內(nèi)還沒有大量可用于工業(yè)化生產(chǎn)的商品酶制劑，而在生產(chǎn)實踐中使用進口柚苷酶將會使企業(yè)生產(chǎn)成本大大增加。柑桔加工過程中的脫苦難題一直是制約柑桔加工業(yè)的一大瓶頸，與此相關的技術研究和成果必將推動柑桔加工產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和柑桔種植業(yè)的發(fā)展，具有十分重要的經(jīng)濟意義和社會意義。以下是柚苷酶在食品工業(yè)中的應用。

3.1果汁的脫苦

許多柑桔類水果已被加工成為果汁產(chǎn)品，但是加工過程中出現(xiàn)的后苦味，致使消費者在口感上難以接受，因而降低了果汁的品質(zhì)，柑桔類水果的商業(yè)價值由于其自身產(chǎn)生的不良苦味而受到限制。酶法脫苦具有專一性強、脫苦效果好、操作簡單、脫苦條件溫和、脫苦效果好，對果汁中其他營養(yǎng)成分及風味無破壞、酶法安全可靠等優(yōu)點，是目前較為理想并最具產(chǎn)業(yè)化應用前景的果汁脫苦方法，必將成為今后柑橘類脫苦研究的趨勢。汪釗等利用黑曲霉ZG86經(jīng)固態(tài)發(fā)酵得到的柚苷酶，柚苷酶加酶量16U/100ppm柚皮苷對柑橘果汁進行脫苦，苦味脫除率達90%。

3.2提高葡萄酒的風味

1994年Caldini等將真菌葡萄糖苷酶固定在固體載體上，其目的是連續(xù)作用于葡萄酒，促進風味的改善，增加酒的風味，同時也對系統(tǒng)的動力學行為和固定化進行了研究。研究α-L-鼠李糖苷酶的活性條件及酶學性質(zhì)對于確定最佳反應條件起到重要作用，為葡萄汁和葡萄酒的生產(chǎn)提供糖苷酶增香調(diào)控的理論參數(shù)，從而在提高葡萄汁和葡萄酒的質(zhì)量和檔次上具有重要的意義

3.3改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑

柚苷酶組成酶系中的α-L-鼠李糖苷酶在食品中的應用可改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑，水解柑桔汁中的柚皮苷和檸檬苦素以去除柑桔汁中的苦味，從而使柑桔汁酸甜可口，口味宜人，原理是通過水解飲料中的類黃酮糖苷、糖甙類物質(zhì)增加水果中黃烷醇物質(zhì)，從而改善水果的功能特性，也是柚苷酶水解脫苦反應中的關鍵酶，這種水解作用在飲料中具有廣泛應用，因此食品工業(yè)中可以用其改善飲料中的香氣成分，包括橘子汁、綠茶、黑醋栗汁等，也可以水解橘皮苷生產(chǎn)甜味劑的前體物，使食品獲得新的高聚物成分從而改善食品的流變特性，因而在生產(chǎn)食品添加劑中具有重要應用。

4展望

目前限制柚苷酶的大規(guī)模工業(yè)化應用方面存在兩個問題：第一個問題是我國缺乏適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)酶菌株，發(fā)展出新的高效的篩選方法目前的當務之急。第二個問題是柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)技術在國內(nèi)還存在著很多的缺陷，在工業(yè)化生產(chǎn)中使用的試劑或載體存在成本偏高、酶法效率低下、穩(wěn)定性較差、連續(xù)操作使用的設備較復雜等缺點，這就需要我們國家進一步開發(fā)出更簡便同時更適用的應用于工業(yè)上的方法，柚苷酶應用于柑桔及其他制品的脫苦與加工國外已有相關報道，但在我國柚苷酶并沒有在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應用，主要原因是國內(nèi)尚無大規(guī)模可用于工業(yè)生產(chǎn)制備的商品柚苷酶出售。今后我們應加強關于柚苷酶高產(chǎn)菌株的選育方法以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等基礎研究工作，作為以后發(fā)展的重要方向特別要注意利用現(xiàn)代分子水平通過DNA基因重組技術，選育出活性高、產(chǎn)酶量大的優(yōu)良理想菌株。

作者：朱運平 郗夢露 白雪 李秀婷 劉瑞山 單位：北京市食品添加劑工程技術研究中心 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 食品質(zhì)量與安全北京實驗室 河南省淼雨飲品股份有限公司