棒狀乳桿菌運用前景探討

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本文作者：馮婷婷、方芳、堵國成、陳堅 單位：江南大學食品與科學技術國家重點實驗室、江南大學生物工程學院

市售泡菜、家庭自制泡菜、發酵香腸、天然奶疙瘩(新疆)、天然發酵酸奶。培養基LB培養基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，蒸餾水100mL；MRS(deman，Rogosa，Sharpe)、BHI(BrainHeartInfusion)、MH(Meller-Hinton)培養基：OXIOD公司。磷酸鹽緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，蒸餾水1000mL，pH7.0。大腸桿菌、產堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC4356)：本實驗室保藏菌株；肺炎克雷伯氏菌：江南大學中國高校工業微生物資源與信息中心；鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌：愛爾蘭國立科克大學。大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌：LB培養基，37℃搖瓶培養；產堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌：LB培養基，30℃搖瓶培養；鼠傷寒沙門氏菌：BHI培養基，37℃搖瓶培養；空腸彎曲桿菌：BHI液體培養基，MH固體培養基，37℃(5%CO2)培養；嗜酸乳桿菌：MRS培養基，37℃(5%CO2)靜置培養；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K：上海生工生物工程有限公司。

從市售泡菜、家庭自制泡菜、發酵香腸、天然奶疙瘩(新疆)、天然發酵酸奶等發酵食品中取樣加到20mLMRS液體培養基中，37℃(5%CO2)靜置富集培養12h。用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)按梯度稀釋培養液，涂布于添加0.5%CaCO3的MRS平板，37℃(5%CO2)靜置培養48h。挑選有溶鈣圈、表面光滑或稍粗糙、不透明、乳白或灰白色、有光澤的單菌落劃線分離到MRS固體培養基上。48h后，選取革蘭陽性、無芽孢、桿狀菌(乳酸桿菌)進行培養和保藏。

挑取上述產生溶鈣圈的乳酸桿菌點種在MRS固體培養基的平板上，37℃(5%CO2)靜置培養24h。然后將培養好的指示菌(大腸桿菌、產堿假單胞菌，107cfu/mL)與軟瓊脂(含瓊脂0.75%~0.8%)培養基按1:100(v/v)混勻，倒在含乳酸桿菌的平板上。適宜溫度下培養過夜，篩選可產生抑菌圈的乳酸桿菌。將具有抑菌效果的乳酸桿菌接種于MRS液體培養基中，37℃(5%CO2)靜置培養24h，離心(8000r/min，4℃)15min取上清液，經0.22μm濾膜過濾后置于4℃冰箱保存。復篩平板底層為2%(w/v)素瓊脂培養基。指示菌為大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌和空腸彎曲桿菌。將培養好的指示菌(107cfu/mL)按1:100(菌液:軟瓊脂體積比)混勻后傾倒在放有牛津杯的底層培養基上。待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL乳酸桿菌發酵上清液，在適宜溫度下培養12~16h，測量抑菌圈直徑。提取乳酸桿菌的全基因組，用16SrDNA的通用引物進行PCR擴增和測序(上海生工生物工程有限公司)。將得到的序列通過BLAST在NCBI中進行序列同源性比對。

將菌株在產胞外多糖培養基上接種后于37℃(5%CO2)靜置培養24h，用接種針挑取菌落觀察是否有拉絲現象。將培養基培養24h的培養物，離心后用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體。將菌體接種到耐鹽性檢測培養基中，于37℃(5%CO2)靜置培養24h，以MRS空白培養基作為空白對照，測定600nm下的OD值，比較菌株的生長情況。將磷酸鹽緩沖液懸浮后的菌體接種到耐硝酸鹽檢測培養基中，于37℃(5%CO2)靜置培養24h，以MRS空白培養基作為空白對照，測定600nm下的OD值，比較生長情況。將懸浮后的菌體穿刺接種于含有溴甲酚紫的軟瓊脂柱中，置于37℃(5%CO2)靜置培養24h，觀察變色情況。軟瓊脂柱顏色由紫色變為黃色說明產酸。在不含溴甲酚紫的軟瓊脂柱中穿刺接種后，在上面加蓋一層約5mm厚的2%瓊脂。若軟瓊脂柱內產生氣泡或2%瓊脂被頂向上的現象，說明有氣體產生。將菌株接種于含有精氨酸溶液的PY培養基中，并將接種于不含精氨酸的PY培養基作為對照，37℃(5%CO2)靜置培養48h。離心后取上清液，向上清液中加入數滴奈氏試劑，若出現橙黃色或黃褐色沉淀，說明產氨。

將菌株劃線接種于MRS液體培養基中，37℃(5%CO2)靜置培養24h，將過氧化氫快速檢測試紙條沒入發酵液1s后取出，10s后觀察變色情況。通過顏色比對判定是否有H2O2產生。將菌株接種于V-P反應培養基中，空白培養基作為對照，37℃(5%CO2)靜置培養24h后，向培養液中加入40%(w/v)KOH溶液10~20滴，再加入等量的5%(w/v)α-萘酚溶液，混勻后于沸水浴加熱2min，若出現紅色則為陽性。將菌株穿刺接種于產H2S檢測培養基中，未接種的培養基作為空白對照，37℃(5%CO2)靜置培養24h。若有黑色物質產生，說明有H2S生成。培養基中，37℃(5%CO2)靜置培養48h，在培養液中加入格里斯試劑，若溶液變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色或棕色則表示硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，反應為陽性，否則為陰性。將接種的石蕊牛奶培養基置于37℃培養24~72h，觀察石蕊牛奶產酸和凝固反應。若石蕊牛奶變為紅色，則有酸產生，當酸度很高時，可使牛奶凝固。將菌株接種于MRS液體培養基中，置于37℃培養72h，以嗜酸乳桿菌ATCC4356作為對照，每隔12h取樣測定pH，觀察pH變化情況。將菌株接種于含有不同氨基酸的生物胺檢測培養基中，37℃(5%CO靜置培養48~72h，觀察顯色情況。若培養基由棕黃色變為紫色，則說明有生物胺產生，并且每種氨基酸都有對應的生物胺(組氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸分別對應組胺、色胺、酪胺、精胺或亞精胺、尸胺、苯乙胺、腐胺)。

從5種食品樣品中共分離到產生溶鈣圈以及外觀符合乳酸桿菌特征的菌株共169株。以大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產堿假單胞菌、熒光假單胞菌、石油假單胞菌、空腸彎曲桿菌和鼠傷寒沙門氏菌為指示菌，從家庭自制泡菜中篩選到一株對7株指示菌都具有抑菌作用的乳酸桿菌BBE-H3。經過16SrDNA序列測序和比對，鑒定出該菌株為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，命名為棒狀乳桿菌BBE-H3。

對棒狀乳桿菌BBE-H3主要發酵特性的檢測結果如表2所示，棒狀乳桿菌BBE-H3具有典型的乳酸菌發酵特性，并且在7種生物胺檢測培養基中，無相應生物胺產生。乳桿菌ATCC4356在發酵12h后，其發酵液的pH變化曲線基本平衡。可見，棒狀乳桿菌BBE-H3產酸速度與嗜酸乳桿菌ATCC4356基本接近，其培養24h后的產酸能力好于嗜酸乳桿菌ATCC4356。

本研究從家庭自制泡菜中篩選到一株對革蘭陰性菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、空腸彎曲桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、產堿假單胞菌、熒光假單胞菌和石油假單胞菌具有抑制作用的棒狀乳桿菌BBE-H3。對棒狀乳桿菌BBE-H3的發酵特性考察結果表明，棒狀乳桿菌BBE-H3具有典型的乳酸菌發酵特性，可耐受8%NaCl和400mg/L的亞硝酸鹽，并且不發酵葡萄糖產氣，不產生物胺、不水解精氨酸產氨、不產H2O2和H2S等影響食品品味的物質，產酸性能好，具有作為發酵食品安全生產菌株的應用前景。