基因工程綜合性實驗教學改革實踐

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【摘要】綜合基因工程實驗課稱重幾個獨立的實驗內容為一個綜合性實驗，以充分利用實驗教學時間，增加內容，改進試驗方法，由學生毒理設計實驗方案，獨立完成實驗內容，讓學生在實驗教學過程中處于主導地位，達到了培養學生獨立思考，獨立操作以及獨立解決問題的綜合能力的目的。

【關鍵詞】基因組；PCR；基因重組；載體構建；篩選；教學改革

基因工程是一門實踐性較強的科學，其要求從事基因工程操作的專業技術人員不但要有深厚的理論基礎，而且具有較強的動手能力。通過幾年的教學實踐，我們嘗試將基因工程中動物胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA的提取、核酸的瓊脂糖凝膠電泳、DN段的回收與純化、PCR反應及其產物檢測、限制性內切酶切割DNA、DNA的重組和連接、大腸桿菌感受態細胞的制備和重組DNA分子的轉化、重組轉化子DNA的鑒定（藍白斑篩選法）、轉化克隆的篩選和鑒定等獨立的實驗內容整合為綜合設計性實驗，將原有的驗證性實驗轉化為探索式的設計性實驗，根據實驗要求，學生自主性選擇實驗組和，提出實驗方案，在老師指導下，獨立完成實驗內容，達到啟發式教學的目的，提高學生學習的積極性和主動性。

一、教師準備

1.確定實驗目的。實驗前，教師確定本次綜合性實驗的實驗目的為構建小鼠β-actin基因的表達載體，讓學生圍繞本實驗目的，運用所學的理論知識，來設計相應的實驗方案，并通過實施自己的實驗方案來鍛煉學生的綜合運用理論知識的能力及實驗設計和操作的能力。2.實驗材料準備。小鼠，恒溫水浴鍋，高速離心機，高壓滅菌鍋，解剖剪，鑷子，微量移液器（1000ul、200ul、100ul、20ul、10ul、2.5ul），加樣槍頭（1000ul、200ul、10ul）離心管，PCR管，瓊脂糖凝膠電泳儀，瓊脂糖，核酸染料，β-actin基因PCR反應試劑，膠回收試劑，大腸桿菌JM109等3.實驗分組。本次實驗共有一個年級三個班級的學生參與，根據學號分組，兩人一小組，四人一大組，小組人數不可太多，人說太多就會造成有些同學對實驗的參與度不夠，要讓每一個同學都參與到實驗當中。4.試驗用具準備。固定兩個實驗室，實驗準備老師將實驗用到的儀器設備等都準備好，供學生使用。

二、實驗過程

1.討論并制定實驗方案。以班級為單位，查閱資料，制定相應的實驗方案，實驗方案要結合運用動物胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA的提取、核酸的瓊脂糖凝膠電泳、DN段的回收與純化、PCR反應及其產物檢測、限制性內切酶切割DNA、DNA的重組和連接、大腸桿菌感受態細胞的制備和重組DNA分子的轉化、重組轉化子DNA的鑒定（藍白斑篩選法）、轉化克隆的篩選和鑒定等基因工程技術，每個班級都要提出一個技術方案或流程。經討論，最后確定了一個實驗目的的三種實驗技術方案。方案一：提取小鼠肝臟細胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴增β-actin基因→PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→表達載體構建→大腸桿菌感受態細胞構建→遺傳轉化→重組子篩選（藍白斑篩選）。方案二：提取小鼠肝臟細胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴增β-actin基因→PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→表達載體構建→遺傳轉化→重組子篩選（藍白斑篩選）。方案三：提取小鼠肝臟細胞基因組DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA→PCR擴增β-actin基因→PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→膠純化目的片段→表達載體構建→遺傳轉化→重組子篩選（藍白斑篩選）。實驗的實施：各班級按照既定的實驗方案進行實驗，實驗過程以小組為單位進行，針對實驗方案中的每一步的技術流程進行討論，總結試驗中出現的問題及解決方法。實驗結束后每組同學提交一個實驗報告，針對試驗方法的優缺點展開討論，提出自己的建議，針對實驗結果進行分析。實驗結果：三種實驗方案都能達到預期實驗目標，即通過重組子篩選（藍白斑篩選）可以得到構建成功的重組表達載體。方案一結果：電泳檢測提取基因組DNA，得到條帶整齊明亮，且對應Marker質量大小的條帶；PCR產物的電泳檢測，得到整齊明亮且對應Marker質量大小的單一條帶；標準質粒轉化制備的感受態大腸桿菌細胞，得到大量藍斑菌落；重組子篩選得到清晰的藍白斑菌落。方案二結果：直接用標準的大腸桿菌感受態細胞做遺傳轉化，降低了感受態細胞制備不成功給實驗帶來的風險，成功了更高。方案三結果：對PCR產物進行膠純化，以純化的片段作為目的片段進行遺傳轉化，提高了轉化子的純度。討論與分析：實驗結束后，以班級為單位，組織學生討論，針對本次實驗過程中出現的問題進行總結，提出改進方法。總結未得到陽性重組子的小組在試驗中的問題，并提出驗證方案。

三、討論

對于這樣的綜合性實驗教學改革，我們總結了近五年的實踐經驗，每年組織一個年級，三個班級進行實踐，大部分同學都能很積極主動的完成實驗內容，增強學生對實驗課堂的主動性與主導性。并通過這樣的實驗教學方式鞏固理論學習，提高自身的操作技能水平，提高學生的團結協作精神，科研素養及獨立解決問題的能力。實驗的方案設計、實施操作，數據記載。結果分析等全部過程都由學生獨立完成，教師在實驗過程中起到輔助作用，充分發揮學生的主導地位，為開放式教學提供了實踐經驗。

作者:朱婷 石曉衛 張靖 張展召 單位:新鄉醫學院三全學院生命科學技術學院