干細胞研發與運用

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胚胎干細胞(ES細胞)是一種高度未分化細胞。它具有發育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。研究和利用ES細胞是當前生物工程領域的核心問題之一。成體干細胞主要有造血干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞和神經干細胞。用于移植的細胞多數來源于外周血、骨髓和臍帶血，也有部分來源于骨骼肌和脂肪組織。雖然胚胎干細胞代表了最原始的全能干細胞，在組織工程和細胞治療中具有廣闊的應用前景，但是它有分化調控機制的復雜性和來源途徑的倫理學爭議;成體干細胞在成體組織中己經保留了發育過程中出現的完整干細胞譜，為干細胞發育機制研究提供了較為理想的模型，但成體干細胞的分化發育潛能己受到限制。隨著干細胞研究的逐步深入，涌現出一些有別于傳統干細胞的新型干細胞，下面就新型干細胞的研究進展做一綜述。

1新型干細胞

1.1誘導多能干細胞(iPS)

2006年日本京都大學Ya-manaka等［1］率先報道了iPS細胞的研究。他把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發現可誘導其發生轉化，產生的iPS細胞在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似［2］。2007年體細胞轉變成“iPS細胞”的成果發表。Hanna等［3］用來自患病小鼠尾巴的皮膚細胞產生了iPS細胞，然后用健康的基因取代了涉及鐮刀形紅細胞貧血癥的基因，研究人員將它們輸給供體小鼠，這些細胞在小鼠身上開始產生健康的血細胞，這些小鼠的疾病癥狀因此有了改善。將實驗鼠皮膚細胞改造成iPS細胞，然后成功使其分化成心肌細胞、血管平滑肌細胞及造血細胞［4］。2009年，中國科學家利用iPS細胞克隆出活體實驗鼠，首次證明iPS細胞與胚胎干細胞一樣具有全能性［5］。因干細胞技術和體細胞核移植技術不同，iPS技術不使用胚胎細胞或卵細胞，因此沒有倫理學的問題。利用iPS技術可以用患者自己的體細胞制備專用的干細胞，因此不會有免疫排斥問題。然而，iPS的研究還只是起步階段，有許多技術難題有待解決。例如現在的iPS技術主要采用病毒載體引入細胞因子，這些病毒隨機插進基因組后存在著激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性，許多方法中還使用了c-Myc原癌基因，因此存在較大的致瘤風險。

1.2SP細胞

利用Hoechst染料進行造血干/祖細胞的流式細胞儀分析時，常會發現一群分布特殊的細胞，經過紫外激發后用雙波長(450nm和675nm以上波長)監測，觀察到這群細胞發出微弱的藍色和紅色熒光，在流式二維分析點陣圖上，呈彗星狀分布在造血干/祖細胞主群的一側，因此被稱為側群(SP)細胞。隨著對SP細胞研究的不斷深入，人們對SP細胞的分布、生物學特征、表型標記、信號轉導機制及其與腫瘤發生的關系等方面的認識都取得了較大進展。近年來大量研究顯示，除了造血系統和血液外，SP細胞在人和動物的許多重要組織器官，如肝、肺、脾、腎、腦、神經等均有廣泛分布，其功能除了參與造血系統的重建外，還與相應組織更新與再生、器官系統的自我重建以及成體干細胞的多器官可塑性有關。SP細胞作為干/祖細胞的一種特殊類型，其發育和分化狀態可能介于胚胎和成體干細胞之間，因此仍具有很強的多向分化潛能和增殖特性;同時，由于SP細胞廣泛分布于各種組織器官中，含量豐富，又具有較明確的表型標記和分離純化方法，所以較好地解決了其來源問題，這對推動干細胞理論研究與發展具有重要的意義，可在應用研究方面為組織工程和細胞治療提供新的干細胞材料來源，也為組織再生修復與原位重建提供了新思路。

1.3Muse細胞

日本學者出澤真理和藤吉好澤率領的研究小組發現的新型干細胞被命名為“Muse細胞”［6］。由于這種干細胞是天然細胞，所以不容易癌變，安全性高于培養時需要植入基因的iPS細胞。存在于成人皮膚和骨髓組織中，含有“SSEA-3”蛋白質的細胞，它們能夠發育成神經、平滑肌、骨骼肌、肝臟等各種組織。將這種細胞移植到實驗鼠受損的皮膚和肝臟以后，這種細胞就與患部結合，成長為受損組織特有的細胞。具有多潛能細胞的特性，但其增殖性不高。這些細胞保留體內的分化能力，與胚胎干細胞不同的是，對免疫缺陷小鼠不構成睪丸畸胎瘤。因為這些細胞很容易獲得，能進入細胞的分化與所有三個胚層的特性，而不需要導入外源基因。因此，對這些細胞為基礎的治療和生物醫學研究具有巨大潛力。

2新型干細胞在心血管疾病方面的應用

2001年有學者首次報道將骨髓干細胞移植到梗死小鼠的心臟中，局部骨髓干細胞能夠分化產生新的心肌細胞，提高心臟功能。隨后有學者報道將骨髓單個核細胞移植到梗死缺血的心臟上，可以提高心肌梗死(MI)患者的心臟功能。此后，心肌再生療法治療成為當今全球的主要熱點。

2.1治療冠心病

干細胞療法為MI的治療帶來了希望。在過去10年進行臨床前和臨床試驗表明，幾種類型的干/祖細胞可以減少梗死面積，改善心臟收縮功能。其機制包括:(1)新血管的形成，(2)介質的釋放有利于血管生成和抗炎因子的釋放，(3)心肌細胞功能恢復。心臟祖細胞和多能干細胞具有不容置疑的分化成心肌細胞和其他相應細胞的能力。因此，以促進細胞的存活及體內植入的干細胞療法是極其重要的發展戰略。目前已完成兩種細胞類型的Ⅲ期臨床試驗:即骨骼肌成肌細胞和骨髓單核細胞(BM-MNCs)。在前者，由于骨骼肌成肌細胞增加了心律失常的風險，使得它的益處受到影響。多數研究表明，BM-MNCs治療組對照組比較療效顯著。iPS細胞被廣泛地應用于各種疾病的研究。由于它具有胚胎干細胞的特性，所以可以被誘導分化為心肌細胞，血管內皮細胞甚至是竇房結細胞。Gai等［7］報道，將人皮膚中成纖維細胞進行基因編程后制作出iPS細胞，在活體上形成與胚胎干細胞一樣的能夠跳動的心肌細胞。iPS細胞可以從患者自身提取，可將基因重新編程，因此對于基因遺傳性心臟病，如心肌病、長QT綜合征、Brugarda綜合征等疾病重新編程，從而治療該類疾病。它的應用不受倫理限制，無免疫排斥反應，具有其他移植細胞不具備的優點。但由于是病毒載體轉染基因，有可能將病毒轉染到宿主細胞，引起宿主病毒感染，甚至有畸胎瘤的風險。目前iPS細胞還用于基礎研究中，尚未在臨床應用。心臟SP細胞(CSP)可分為SCA1(+)/CD31(－)和SCA1(+)/CD31(+)SP細胞。利用熒光激活細胞分選，逆轉錄聚合酶鏈反應，檢測細胞的增殖、分化和遷移等方法，在小鼠MI模型上SCA1(+)/CD31(+)CSP細胞表達干細胞和血管內皮細胞的特定基因，并駐留在血管中。這些細胞在體外和體內均能夠增殖、分化、遷移和血管化。SDF-1α體外誘導這些細胞的遷移。更重要的是，MI后，SCA1(+)/CD31(+)SP細胞可以從非缺血區遷移到缺血區心肌，并形成筒狀血管的結構［8］。研究結果表明，SCA1(+)/CD31(+)的心臟SP細胞能夠從非缺血性心臟部位遷移到受損的心肌急性缺血性損傷的心肌細胞。SDF-1α/CXCR4系統可能會在這些細胞的遷移中發揮的重要作用［9］。

2.2治療心力衰竭

目前心力衰竭的治療方法有限，細胞療法是一種很有前途的戰略。心肌干/祖細胞具有的各種潛力，修復受損的心臟組織，包括更換(組織移植)、恢復(激活原位心肌祖細胞，旁分泌作用)和再生(干細胞植入形成新的細胞)。治療心力衰竭的目的是補充收縮失敗的心肌單元，但能夠被成功誘導出cardiomyogenesis的數量有限，因此改善心功能程度較小，此時旁分泌機制可能更重要。目前對于治療最有效的細胞類型仍不清楚，iPS細胞具有很大的潛力。宿主心肌細胞融合和結合的途徑仍然有爭議。作用機制、細胞類型或交付方式，時間效力和細胞治療，藥物治療或輔助治療劑量，以及最佳的細胞類型等還需要更多的研究。有研究表明，嚙齒類動物和人類骨髓來源的SP細胞均能夠在心肌上存活，人類骨髓衍生的SP細胞在增強左室收縮功能方面優于普通骨髓單個核細胞［10］。有關SP細胞的研究目前還在基礎研究中，其是具有研究和開發潛力的一類新型干細胞。

2.3治療心律失常

起搏生物基因療法治療病態竇房結綜合征，心臟傳導阻滯等緩慢性心律失常已經取得了長足進步［11－12］。此外，人類iPS細胞已被核實為藥物篩選有用的工具。很多個體對心臟活性藥物的反應有差異，利用ES細胞源性心肌細胞或iPS細胞來源的心肌細胞，篩選出個性化定制的抗心律失常藥物，可以個體化治療心律失常患者。

2.4心臟瓣膜的組織工程

組織工程心臟瓣膜的三大要素有種子細胞，細胞支架材料和細胞支架的復合，重構。應用生物可降解聚合物支架構建組織工程心臟瓣膜，已在動物實驗中取得初步結果，為心臟瓣膜研制開辟了新途徑。用于組織工程心臟瓣膜的種子細胞有內皮祖細胞、骨髓間充質干細胞以及ES細胞。組織工程心臟瓣膜研究已經取得了很大進展，但是還有很多問題尚待解決和克服。如如何進一步提高種子細胞與支架的黏附力，干細胞定向分化中是否會引起基因突變和腫瘤等問題。然而，隨著干細胞技術和組織工程技術的日益發展，這些難題終將得到解決。

2.5治療肺動脈高壓

肺動脈高壓是一種病死率極高的疾病，患者從確診到死亡，平均存活時間僅2.8年。由于患者癥狀不明顯，往往確診時已是病情后期。目前國內外均無特別有效的方法，少數大醫院嘗試肺移植治療，但手術風險大，費用高，而且供體來源受限。干細胞治療肺動脈高壓是通過抗增殖和治療性血管新生，達到降低肺動脈壓的作用。有人經體外分離提取內皮祖細胞，培養擴增后，將內皮祖細胞通過導管回輸到肺動脈，從而促進血管新生，改變內皮功能。由于是自體移植，手術安全性好，并發癥少。該研究領域可能在不遠的將來在干細胞治療上會有突破［13］。

總之，心臟干細胞和祖細胞修復的研究給人類心肌再生治療帶來很大的希望。直到現在，若干問題還有待于進一步研究，如移植的細胞類型、劑量、時間和交付心肌干細胞的治療模式等。管如此，細胞療法仍一種很有前途的治療方法。人類不斷探索的腳步永遠不會停止。具有很大發展潛力的iPS細胞和新的干細胞的開發，給人們很大的鼓舞。相信在不遠的將來，人類會充分利用干細胞的優勢為人類造福。