干細(xì)胞研發(fā)與運(yùn)用

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胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是一種高度未分化細(xì)胞。它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。研究和利用ES細(xì)胞是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的核心問題之一。成體干細(xì)胞主要有造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。用于移植的細(xì)胞多數(shù)來源于外周血、骨髓和臍帶血，也有部分來源于骨骼肌和脂肪組織。雖然胚胎干細(xì)胞代表了最原始的全能干細(xì)胞，在組織工程和細(xì)胞治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，但是它有分化調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性和來源途徑的倫理學(xué)爭議;成體干細(xì)胞在成體組織中己經(jīng)保留了發(fā)育過程中出現(xiàn)的完整干細(xì)胞譜，為干細(xì)胞發(fā)育機(jī)制研究提供了較為理想的模型，但成體干細(xì)胞的分化發(fā)育潛能己受到限制。隨著干細(xì)胞研究的逐步深入，涌現(xiàn)出一些有別于傳統(tǒng)干細(xì)胞的新型干細(xì)胞，下面就新型干細(xì)胞的研究進(jìn)展做一綜述。

1新型干細(xì)胞

1.1誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)

2006年日本京都大學(xué)Ya-manaka等［1］率先報(bào)道了iPS細(xì)胞的研究。他把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似［2］。2007年體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成“iPS細(xì)胞”的成果發(fā)表。Hanna等［3］用來自患病小鼠尾巴的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生了iPS細(xì)胞，然后用健康的基因取代了涉及鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥的基因，研究人員將它們輸給供體小鼠，這些細(xì)胞在小鼠身上開始產(chǎn)生健康的血細(xì)胞，這些小鼠的疾病癥狀因此有了改善。將實(shí)驗(yàn)鼠皮膚細(xì)胞改造成iPS細(xì)胞，然后成功使其分化成心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及造血細(xì)胞［4］。2009年，中國科學(xué)家利用iPS細(xì)胞克隆出活體實(shí)驗(yàn)鼠，首次證明iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣具有全能性［5］。因干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同，iPS技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，因此沒有倫理學(xué)的問題。利用iPS技術(shù)可以用患者自己的體細(xì)胞制備專用的干細(xì)胞，因此不會(huì)有免疫排斥問題。然而，iPS的研究還只是起步階段，有許多技術(shù)難題有待解決。例如現(xiàn)在的iPS技術(shù)主要采用病毒載體引入細(xì)胞因子，這些病毒隨機(jī)插進(jìn)基因組后存在著激活致癌基因或抑制抑癌基因的可能性，許多方法中還使用了c-Myc原癌基因，因此存在較大的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。

1.2SP細(xì)胞

利用Hoechst染料進(jìn)行造血干/祖細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析時(shí)，常會(huì)發(fā)現(xiàn)一群分布特殊的細(xì)胞，經(jīng)過紫外激發(fā)后用雙波長(450nm和675nm以上波長)監(jiān)測，觀察到這群細(xì)胞發(fā)出微弱的藍(lán)色和紅色熒光，在流式二維分析點(diǎn)陣圖上，呈彗星狀分布在造血干/祖細(xì)胞主群的一側(cè)，因此被稱為側(cè)群(SP)細(xì)胞。隨著對SP細(xì)胞研究的不斷深入，人們對SP細(xì)胞的分布、生物學(xué)特征、表型標(biāo)記、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系等方面的認(rèn)識都取得了較大進(jìn)展。近年來大量研究顯示，除了造血系統(tǒng)和血液外，SP細(xì)胞在人和動(dòng)物的許多重要組織器官，如肝、肺、脾、腎、腦、神經(jīng)等均有廣泛分布，其功能除了參與造血系統(tǒng)的重建外，還與相應(yīng)組織更新與再生、器官系統(tǒng)的自我重建以及成體干細(xì)胞的多器官可塑性有關(guān)。SP細(xì)胞作為干/祖細(xì)胞的一種特殊類型，其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎和成體干細(xì)胞之間，因此仍具有很強(qiáng)的多向分化潛能和增殖特性;同時(shí)，由于SP細(xì)胞廣泛分布于各種組織器官中，含量豐富，又具有較明確的表型標(biāo)記和分離純化方法，所以較好地解決了其來源問題，這對推動(dòng)干細(xì)胞理論研究與發(fā)展具有重要的意義，可在應(yīng)用研究方面為組織工程和細(xì)胞治療提供新的干細(xì)胞材料來源，也為組織再生修復(fù)與原位重建提供了新思路。

1.3Muse細(xì)胞

日本學(xué)者出澤真理和藤吉好澤率領(lǐng)的研究小組發(fā)現(xiàn)的新型干細(xì)胞被命名為“Muse細(xì)胞”［6］。由于這種干細(xì)胞是天然細(xì)胞，所以不容易癌變，安全性高于培養(yǎng)時(shí)需要植入基因的iPS細(xì)胞。存在于成人皮膚和骨髓組織中，含有“SSEA-3”蛋白質(zhì)的細(xì)胞，它們能夠發(fā)育成神經(jīng)、平滑肌、骨骼肌、肝臟等各種組織。將這種細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)鼠受損的皮膚和肝臟以后，這種細(xì)胞就與患部結(jié)合，成長為受損組織特有的細(xì)胞。具有多潛能細(xì)胞的特性，但其增殖性不高。這些細(xì)胞保留體內(nèi)的分化能力，與胚胎干細(xì)胞不同的是，對免疫缺陷小鼠不構(gòu)成睪丸畸胎瘤。因?yàn)檫@些細(xì)胞很容易獲得，能進(jìn)入細(xì)胞的分化與所有三個(gè)胚層的特性，而不需要導(dǎo)入外源基因。因此，對這些細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療和生物醫(yī)學(xué)研究具有巨大潛力。

2新型干細(xì)胞在心血管疾病方面的應(yīng)用

2001年有學(xué)者首次報(bào)道將骨髓干細(xì)胞移植到梗死小鼠的心臟中，局部骨髓干細(xì)胞能夠分化產(chǎn)生新的心肌細(xì)胞，提高心臟功能。隨后有學(xué)者報(bào)道將骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植到梗死缺血的心臟上，可以提高心肌梗死(MI)患者的心臟功能。此后，心肌再生療法治療成為當(dāng)今全球的主要熱點(diǎn)。

2.1治療冠心病

干細(xì)胞療法為MI的治療帶來了希望。在過去10年進(jìn)行臨床前和臨床試驗(yàn)表明，幾種類型的干/祖細(xì)胞可以減少梗死面積，改善心臟收縮功能。其機(jī)制包括:(1)新血管的形成，(2)介質(zhì)的釋放有利于血管生成和抗炎因子的釋放，(3)心肌細(xì)胞功能恢復(fù)。心臟祖細(xì)胞和多能干細(xì)胞具有不容置疑的分化成心肌細(xì)胞和其他相應(yīng)細(xì)胞的能力。因此，以促進(jìn)細(xì)胞的存活及體內(nèi)植入的干細(xì)胞療法是極其重要的發(fā)展戰(zhàn)略。目前已完成兩種細(xì)胞類型的Ⅲ期臨床試驗(yàn):即骨骼肌成肌細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞(BM-MNCs)。在前者，由于骨骼肌成肌細(xì)胞增加了心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，使得它的益處受到影響。多數(shù)研究表明，BM-MNCs治療組對照組比較療效顯著。iPS細(xì)胞被廣泛地應(yīng)用于各種疾病的研究。由于它具有胚胎干細(xì)胞的特性，所以可以被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞甚至是竇房結(jié)細(xì)胞。Gai等［7］報(bào)道，將人皮膚中成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因編程后制作出iPS細(xì)胞，在活體上形成與胚胎干細(xì)胞一樣的能夠跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。iPS細(xì)胞可以從患者自身提取，可將基因重新編程，因此對于基因遺傳性心臟病，如心肌病、長QT綜合征、Brugarda綜合征等疾病重新編程，從而治療該類疾病。它的應(yīng)用不受倫理限制，無免疫排斥反應(yīng)，具有其他移植細(xì)胞不具備的優(yōu)點(diǎn)。但由于是病毒載體轉(zhuǎn)染基因，有可能將病毒轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，引起宿主病毒感染，甚至有畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。目前iPS細(xì)胞還用于基礎(chǔ)研究中，尚未在臨床應(yīng)用。心臟SP細(xì)胞(CSP)可分為SCA1(+)/CD31(－)和SCA1(+)/CD31(+)SP細(xì)胞。利用熒光激活細(xì)胞分選，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，檢測細(xì)胞的增殖、分化和遷移等方法，在小鼠MI模型上SCA1(+)/CD31(+)CSP細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特定基因，并駐留在血管中。這些細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能夠增殖、分化、遷移和血管化。SDF-1α體外誘導(dǎo)這些細(xì)胞的遷移。更重要的是，MI后，SCA1(+)/CD31(+)SP細(xì)胞可以從非缺血區(qū)遷移到缺血區(qū)心肌，并形成筒狀血管的結(jié)構(gòu)［8］。研究結(jié)果表明，SCA1(+)/CD31(+)的心臟SP細(xì)胞能夠從非缺血性心臟部位遷移到受損的心肌急性缺血性損傷的心肌細(xì)胞。SDF-1α/CXCR4系統(tǒng)可能會(huì)在這些細(xì)胞的遷移中發(fā)揮的重要作用［9］。

2.2治療心力衰竭

目前心力衰竭的治療方法有限，細(xì)胞療法是一種很有前途的戰(zhàn)略。心肌干/祖細(xì)胞具有的各種潛力，修復(fù)受損的心臟組織，包括更換(組織移植)、恢復(fù)(激活原位心肌祖細(xì)胞，旁分泌作用)和再生(干細(xì)胞植入形成新的細(xì)胞)。治療心力衰竭的目的是補(bǔ)充收縮失敗的心肌單元，但能夠被成功誘導(dǎo)出cardiomyogenesis的數(shù)量有限，因此改善心功能程度較小，此時(shí)旁分泌機(jī)制可能更重要。目前對于治療最有效的細(xì)胞類型仍不清楚，iPS細(xì)胞具有很大的潛力。宿主心肌細(xì)胞融合和結(jié)合的途徑仍然有爭議。作用機(jī)制、細(xì)胞類型或交付方式，時(shí)間效力和細(xì)胞治療，藥物治療或輔助治療劑量，以及最佳的細(xì)胞類型等還需要更多的研究。有研究表明，嚙齒類動(dòng)物和人類骨髓來源的SP細(xì)胞均能夠在心肌上存活，人類骨髓衍生的SP細(xì)胞在增強(qiáng)左室收縮功能方面優(yōu)于普通骨髓單個(gè)核細(xì)胞［10］。有關(guān)SP細(xì)胞的研究目前還在基礎(chǔ)研究中，其是具有研究和開發(fā)潛力的一類新型干細(xì)胞。

2.3治療心律失常

起搏生物基因療法治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征，心臟傳導(dǎo)阻滯等緩慢性心律失常已經(jīng)取得了長足進(jìn)步［11－12］。此外，人類iPS細(xì)胞已被核實(shí)為藥物篩選有用的工具。很多個(gè)體對心臟活性藥物的反應(yīng)有差異，利用ES細(xì)胞源性心肌細(xì)胞或iPS細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，篩選出個(gè)性化定制的抗心律失常藥物，可以個(gè)體化治療心律失常患者。

2.4心臟瓣膜的組織工程

組織工程心臟瓣膜的三大要素有種子細(xì)胞，細(xì)胞支架材料和細(xì)胞支架的復(fù)合，重構(gòu)。應(yīng)用生物可降解聚合物支架構(gòu)建組織工程心臟瓣膜，已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得初步結(jié)果，為心臟瓣膜研制開辟了新途徑。用于組織工程心臟瓣膜的種子細(xì)胞有內(nèi)皮祖細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及ES細(xì)胞。組織工程心臟瓣膜研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但是還有很多問題尚待解決和克服。如如何進(jìn)一步提高種子細(xì)胞與支架的黏附力，干細(xì)胞定向分化中是否會(huì)引起基因突變和腫瘤等問題。然而，隨著干細(xì)胞技術(shù)和組織工程技術(shù)的日益發(fā)展，這些難題終將得到解決。

2.5治療肺動(dòng)脈高壓

肺動(dòng)脈高壓是一種病死率極高的疾病，患者從確診到死亡，平均存活時(shí)間僅2.8年。由于患者癥狀不明顯，往往確診時(shí)已是病情后期。目前國內(nèi)外均無特別有效的方法，少數(shù)大醫(yī)院嘗試肺移植治療，但手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，費(fèi)用高，而且供體來源受限。干細(xì)胞治療肺動(dòng)脈高壓是通過抗增殖和治療性血管新生，達(dá)到降低肺動(dòng)脈壓的作用。有人經(jīng)體外分離提取內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增后，將內(nèi)皮祖細(xì)胞通過導(dǎo)管回輸?shù)椒蝿?dòng)脈，從而促進(jìn)血管新生，改變內(nèi)皮功能。由于是自體移植，手術(shù)安全性好，并發(fā)癥少。該研究領(lǐng)域可能在不遠(yuǎn)的將來在干細(xì)胞治療上會(huì)有突破［13］。

總之，心臟干細(xì)胞和祖細(xì)胞修復(fù)的研究給人類心肌再生治療帶來很大的希望。直到現(xiàn)在，若干問題還有待于進(jìn)一步研究，如移植的細(xì)胞類型、劑量、時(shí)間和交付心肌干細(xì)胞的治療模式等。管如此，細(xì)胞療法仍一種很有前途的治療方法。人類不斷探索的腳步永遠(yuǎn)不會(huì)停止。具有很大發(fā)展?jié)摿Φ膇PS細(xì)胞和新的干細(xì)胞的開發(fā)，給人們很大的鼓舞。相信在不遠(yuǎn)的將來，人類會(huì)充分利用干細(xì)胞的優(yōu)勢為人類造福。