成體干細胞在泌尿系統疾病重建中的應用

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摘要：干細胞是目前生命科學研究的熱點方向。干細胞具有自我更新及定向分化的潛在能力。近年來，干細胞移植治療在治療壓力性尿失禁和膀胱損傷方面已成為研究重點，不同來源的干細胞在治療膀胱損傷已取得矚目的研究成果。干細胞對陰莖勃起神經和海綿體血管內皮細胞起著修復保護作用。干細胞具有向多種譜系細胞轉化的能力來治療壓力性尿失禁。干細胞移植為泌尿系統的神經肌肉疾病的修復重建提供了一條新途徑，使認為不可修復的的神經肌肉疾病的結構修復和組織重建成為可能。干細胞包括脂肪干細胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs)、骨髓間充質干細胞（bonenarrowmesenchymalstem，BMSCs）和肌源性干細胞（muscle-derivedstemcell，MDSCs）等。組織工程學是一類交叉學科，主要包括綜合細胞培養、材料構建和細胞種植等。組織工程技術為泌尿外科臨床醫師提供了一條修復乃至重建受損臟器的新思路。本文就利用干細胞作為種子細胞，對膀胱缺損、壓力性尿失禁、勃起功能障礙泌尿系疾病的組織工程修復進行綜述。

關鍵詞：干細胞；組織工程技術；尿路重建；泌尿外科

前言

干細胞是低分化或未分化的細胞，其具有自我更新、高效增殖能力和多向分化潛能的細胞。根據干細胞分化過程，干細胞的分化階段可以分為以下四類：1）、全能干細胞（受精卵），2）、多潛能干細胞（胚源性干細胞），3）、多能干細胞（成人干細胞），4）、單能干細胞（祖細胞）[1]。多能干細胞具有分化出多種細胞組織的潛能，是體內發現的一種未分化細胞.骨髓、肌組織、血管內皮、皮膚及脂肪等處可以通過一定方式獲取多能干細胞，從而避免了獲取胚胎干細胞時的倫理問題。因為多能干細胞不會轉化為惡性表型，降低了植入體內后形成畸胎瘤的風險，多能干細胞引起了醫學界的廣泛關注[2]。在泌尿系修復與重建中用常常用到多能干細胞。干細胞包括脂肪干細胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs)、骨髓間充質干細胞（bonenarrowmesenchymalstem，BMSCs）和肌源性干細胞（muscle-derivedstemcell，MDSCs）等。ADSCs是一種從脂肪組織基質中極易分離得到的成體干細胞，ADSCs具有增殖能力強、多向分化潛能并且不涉及免疫排斥的優勢[3]。脂肪組織在人體內來源廣泛，獲取簡便，ADSCs可以通過抽脂及傳代培養從中獲取，不僅具有穩定的體外多代增殖能力，而且在不同的誘導因子作用下，ADSCs可以向脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、成骨細胞、神經細胞、神經膠質細胞及胰島細胞分化，并且可以分泌多種促血管生長因子、血管內皮生長因子，肝細胞生長因子及抗凋亡因子并且作為基因治療的靶細胞具有抗炎抗氧化作用[4]。BMSCs是一種能夠自我增殖，可自體移植和較強的橫向分化潛能和可塑性的成纖維細胞，可以分化成內胚層細胞、中胚層細胞和外胚層細胞。例如在體內外可以分化為肌細胞，肝細胞，成骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞和神經元細胞等多種細胞。許多研究室經研究發現BMSCs的亞群包括多能成體祖干細胞、骨髓來源成人多向誘導細胞和小胚胎樣干細胞，這些亞群都具有BMSCs的異質性并且可能是那些可以分化為內外胚層細胞、已經確定好譜系的細胞來源[5]。MDSCs作為一種存在成體肌肉組織中具有良好的自我更新和增殖能力的自體成體干細胞，在細胞移植和基因治療方面具有廣闊的前景。骨骼肌中分離出兩種細胞，一種是僅能分化成肌源性組織的骨骼肌衛星細胞；另一種是具有干細胞功能的MDSCs，存在于骨骼肌肌纖維外面，是一種分裂能力很強的肌細胞。與肌衛星細胞比，不僅能促進肌組織再生，還能分化成成骨骼肌纖維和包括肌肉、脂肪、骨、軟骨等中胚層類型及包括神經樣細胞在內的外胚層細胞。因在泌尿外科疾病中這三種細胞發揮著重大作用，在下文中將著重論述。

1膀胱的修復重建

膀胱腫瘤、慢性膀胱炎、膀胱結核或創傷等很多臨床上常見的膀胱疾病都會導致膀胱功能障礙或結構缺損，臨床上常常用腸道來替代膀胱進行修補作為常規的治療方案。但由于腸道和膀胱在解剖結構和功能上的差別，所以術后效果往往不盡如人意，許多并發癥如粘液性液體的產生、電解質紊亂、尿路結石形成、腫瘤復發也相繼發生。干細胞治療技術的出現及應用為膀胱解剖結構缺損及功能障礙的修復重建提供了基礎。Zhu等[6]研究發現ADSCs可以用來修復重建膀胱組織，首先將培養好的ADSCs種植在膀胱無細胞基質移植物（bladderacellularmatrixgrafts，BAMGs)上，然后取24只雄性成年白兔，分別在膀胱表面切除1.5×1.5cm的缺損處，再將雄性成年白兔隨機分成兩組，實驗組將種植ADSCs的BAMGs用5-0薇橋縫合于膀胱缺損處，對照組則將無ADSCs的BAMGs以相同方式縫合于膀胱缺損處。并于4、12、24周時每組分別定期處死四只白兔，用膀胱回流造影的方法檢測，觀察到實驗組和對照組相比，實驗組的膀胱形態更加接近正常膀胱形態，并且膀胱容量較術前和對照組均有提高，分別為3.31%和5.65%。在組織學上種植有ADSCs的BAMGs表現出同周邊正常膀胱組織相同的光滑肌肉組織，ADSCs促進新生的血管形成和神經細胞增殖。同時實驗結果表明通過體內外誘導的方式ADSCs能向膀胱平滑肌細胞（smoothmusclecell，SMC)分化，SMC可以表達平滑肌特異性的標志物并具備收縮和舒張的功能，可以用于修復重建膀胱基層缺損。LiuG等[7]將ADSCs植入膀胱周圍神經缺損的小鼠模型中，經過組織學檢查分析得出植入ADSCs的受損膀胱周圍神經纖維數量，軸突直徑和髓鞘厚度較模型組顯著提高。研究表明脂肪干細胞可以促進膀胱周圍神經損傷的修復重建。對于膀胱神經損傷的治療有著重要性的幫助。提高膀胱貯存和排泄尿液的功能對于無論是患有先天性或者獲得性膀胱缺損的患者來說膀胱組織再生是最理想并最可行的應用。而在組織再生中，一項重要的進展就是確定MD-SCs可以向組織特殊分化方向進行誘導[8]。在特定培養基中培養的MDSCs經過一段時間的誘導分化，通過免疫學分析可以得到平滑肌細胞表型、染色陽性的α平滑肌肌動蛋白和肌球蛋白等平滑肌細胞特征性標志[9]。Tian等[10]研究發現在一個聚乳酸纖維三維支架上可以將MDSCs分化培養為平滑肌細胞。Anumanthan等[11]報道了將14只大鼠膀胱間充質組織與小鼠股骨、脛骨來源的MDSCs復合后植入小鼠腎被膜下，12周后通過免疫組化染色可見小鼠MDSCs來源的尿路上皮細胞結構，進一步證明了在適當誘導環境下，MDSCs能夠向內胚層起源的尿路上皮細胞分化誘導。

2尿失禁的干細胞治療

尿失禁是由于神經功能障礙或膀胱括約肌損傷而喪失排尿自控能力，使尿液不自主地流出。女性最常見的尿失禁按照癥狀可分為壓力性尿失禁、急迫性尿失禁及壓力急迫混合性尿失禁。根據流行病學統計：女性人群中23%-45%有不同程度的尿失禁，7%左右有明顯的尿失禁癥狀，其中約50%為壓力性尿失禁。壓力性尿失禁（stressurinaryincontinenceSUI）是指在體力活動或咳嗽打噴嚏等腹壓增加時不自主的尿液漏，45歲到65歲的婦女10%～80%患有SUI。最新的證據表明"括約肌單元"異常是導致SUI最重要的因素，這種"括約肌單元"包括尿道外括約肌，平滑肌層，神經元，血管叢，粘膜下層和上皮細胞。尿道及括約肌單位的萎縮、結締組織的變化、尿道周圍的血液灌注和神經元質量的改變均促進SUI的發展[12]。最新實驗研究表明[13]在尿失禁大鼠模型的膀胱外周注射ADSCs，可觀察到ADSCs可促進平滑肌細胞分化及膠原蛋白含量的升高并可提高尿道排尿的功能。Wu等[14]研究發現將ADSCs移植入SUI模型大鼠尿道中，2周后對實驗組及對照組進行尿動力學檢測，干細胞移植組與對照組相比，大鼠的膀胱最大容量得到明顯改善并恢復到正常大鼠最大膀胱容量，移植組大鼠的腹壓漏尿點壓升高、最大尿道閉合壓和功能性尿道長度也得到顯著升高。Jack等[15]實驗結果表明用大鼠體內自身的脂肪組織分離培養出ADSCs，并將ADSCs移植入大鼠膀胱和尿道中，可以觀察到ADSCs不僅僅可以存活并且還可以分化成平滑肌細胞[16]。給脂肪組織提取細胞注射熒光標記物，12周后將檢測被熒光標記物標記脂肪干細胞注射到大鼠的膀胱和尿道中，一定時間后對實驗組和對照組大鼠進行分析后發現ADSCs已混入到有活性的平滑肌細胞中。在另一項研究中，ADSCs以可降解生物微球形式注射到損傷的大鼠尿道周圍，ADSCs可化為有功能的平滑肌并可維持近似正常的漏尿點壓和逆行性尿道灌注壓力。張[17]等實驗表明在給患有2型糖尿病的SUI大鼠尾靜脈和逼尿肌注射ADSCs，治療后的SUI大鼠膀胱排泄功能明顯改善，并且2型糖尿病SUI大鼠粘膜層凋亡細胞數目減少，粘膜下毛細血管網的完整性也得到明顯提高，并且這兩種治療效果無明顯統計學差異，因此靜脈注射AD-SCs為臨床上治療SUI提供了可行性。Yamamoto等[18]報道了2例根治性前列腺切除術后SUI患者，經尿道周圍注射ADSCs治療，12周后取得了比較理想的治療效果，表明自體ADSCs尿道周圍注射治療SUI是安全可行的。為了提高移植后干細胞的成活，一些研究將生長因子與干細胞共移植，尤其將稀釋的生長因子與干細胞共移植，顯著提高了干細胞成活率，提高控尿效果[19]。

3勃起功能障礙的干細胞治療

勃起功能障礙是男性常見疾病，勃起功能障礙（erectiledysfunction，ED）是指男性持續性或反復發作性的難以達到和維持陰莖勃起，進而無法完成性交或滿意性活動的病理現象。陰莖的勃起依賴于一系列正常的神經和血管性反應，包括正常的性心理反應，正常的內分泌、神經和血管功能等，其中任何一個環節的異常都有可能導致ED的發生。患者出現ED的直接原因是陰莖海綿體神經（CN）損傷所引起的勃起神經反射中斷，并且在CN損傷后，陰莖海綿體組織中的平滑肌細胞和內皮細胞凋亡數目增加，海綿體平滑肌纖維數量減少從而加重了ED的發生[20]。GuitingLin等[21]將自體分離培養的ADSCs注射到受損的大鼠陰莖海綿體內，5周后經測量表明實驗組較對照組海綿體的壓力明顯增加。實驗證明ADSCs在特定的培養基誘導下，ADSCs在體外可以分化為神經元樣細胞、平滑肌細胞和內皮細胞等。胰島素樣生長因子和胰島素樣生長因子受體（IGF/IGFR）通路參與血管內皮細胞的分化，有利于ADSCs促進神經性勃起功能障礙的恢復。Kim等[22]通過純化、濃縮、基因轉染將從雌性大鼠的骨骼肌內分離培養出MDSCs注入雙側陰莖海綿體神經損傷的大鼠陰莖海綿體內，經過4周的治療與對照組相比，實驗組的最高海綿體內壓和神經標記蛋白基因產物9.5都有極大的提高。組織學研究發現移植后的MDSCs可與平滑肌細胞相互融合進而改善陰莖的勃起功能。邱雪峰等[23]實驗發現向雄性大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素誘導制備成糖尿病性ED，并將分離培養的第三代骨髓間充質干細胞移植到糖尿病性ED大鼠左側的陰莖海綿體內。糖尿病ED治療組較未治療組大鼠的ICP顯著提高，陰莖海綿體組織結構也得到明顯改善，勃起明顯提高。Muammer等[24]研究發現給雙側陰莖海綿體神經損傷的大鼠陰莖內注射P75dMSCs，除了假組，實驗組與其他組比較不僅僅表達出較高的海綿體內壓力，而且p75dM-SCs分泌表達的堿性成纖維細胞生長因子經ELISA結果表明可保護促進損傷后的海綿體神經修復。Bivalacqua等[25]將用含有eNOS基因的腺病毒轉染后的大鼠間充質干細胞注入大鼠陰莖海綿體內，發現rMSCs注入陰莖海綿體陰莖后至少可存活21天，并且無炎癥反應。海綿體內注射eNOS基因修飾的rMSCs后大鼠勃起功能在第7天和第21天，都有明顯改善，而未注入修飾的MSCs，第21天勃起功能才有明顯提高。兩者均伴有移植細胞內皮的平滑肌特異標記物免疫染色陽性。

4小結與展望

綜上所述，在組織工程學的應用中，干細胞為臨床患者帶來了新的希望。干細胞對于泌尿外科疾病如膀胱損傷、壓力性尿失禁、陰莖勃起功能障礙等常見疾病的修復重建有著極其重要的意義。干細胞通過其特殊的分化誘導成脂肪干細胞、骨髓間充質干細胞和肌源性干細胞來完成對神經的修復及組織的重建。多能干細胞作為種子細胞在治療泌尿外科疾病已經進入臨床階段，多能干細胞在治療泌尿系統疾病具有著巨大的應用前景，雖然仍然有一些問題亟待解決如干細胞應用時的倫理問題和轉化時帶來的致瘤性風險，但相信在不久的未來可以看到更多干細胞在泌尿外科領域中的應用。

作者:花永亮 單位:哈爾濱醫科大學附屬第一醫院泌尿外科三科