脂肪干細胞在泌尿系統疾病中的研究
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摘要：脂肪干細胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）是一類從脂肪分離出來的具有自我更新及多向分化潛能的成體干細胞，AD-SCs具有高度的可塑性，可分化成多種類型的細胞。與其他干細胞相比，ADSCs具有來源充足，取材方便，供體易接受等獨特優勢，已成為基礎醫學及臨床治療的研究熱點。ADSCs誘導分化和移植可有效治療多種組織損傷性疾病，改善或修復器官功能，近年來ADSCs作為細胞療法及組織工程的新型種子細胞在泌尿系統疾病治療中取得了重大進展。本文重點討論ADSCs的生物學特性及其在泌尿系統疾病中的應用前景。
關鍵詞：脂肪干細胞；泌尿系統疾病；組織工程
前言
脂肪干細胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）是從脂肪分離獲得、屬于中胚層來源的間充質干細胞。ADSCs最初是由Zuk等[1]人利用負壓抽脂術從脂肪組織懸液中分離培養出的類成纖維樣細胞，發現它們在特定誘導條件下，可定向分化成脂肪細胞，軟骨細胞，成肌細胞和成骨細胞，并首次證實其為多功能干細胞。近年來，骨髓間充質干細胞（bonemarrowderivedstemcells,BMSCs）一直是國內外學者研究的熱點，但由于其提取困難，來源較少，患者因疼痛較難接受等缺點，使其在臨床應用過程中受到極大的限制。2003年，DeUgarte實驗室首次從同一患者體內提取培養ADSCs和BMSCs，對其比較發現，兩者在細胞形態，生長動力學，細胞衰老，多向分化能力及基因轉導效率五個方面均無顯著性差異[2]。而與BMSCs相比，ADSCs具有來源充足，提取簡單，易自體取材，對供體傷害小等獨特優勢，使其有望成為基礎醫學研究和臨床治療的新型種子細胞。目前已有文獻報道，ADSCs可誘導分化成腎臟上皮細胞，并在膀胱及輸尿管修復中取得了初步進展，在很大程度上解決了腎臟和尿路器官的修復與重建及免疫排斥等諸多棘手難題[3-6]。本文主要就ADSCs的生物學特性及其在泌尿系統疾病中的作用和機制作以簡要綜述。
1ADSCs的生物學特性
1.1ADSCs的細胞形態
ADSCs為貼壁細胞，原代接種后5-7d為生長滯后期，細胞呈梭形或圓形，核多居中，部分細胞可見雙核或多核，核漿比較大。經傳代后，細胞增殖迅速，體積增大，細胞逐漸趨向成纖維樣生長，呈渦旋狀緊密排列。ADSCs穩定性相對較好，經多次傳代后細胞形態無明顯改變[1]。
1.2ADSCs的分離培養與鑒定
目前為止，ADSCs主要的分離培養方式是將手術中取得的脂肪組織進行反復沖洗和剪碎，制成脂肪組織懸液，用胰酶或膠原酶消化、離心后，棄去上層液體和殘余脂肪，培養液重懸沉淀后進行培養，大多選用的培養液為經典的10%的胎牛血清成纖維培養液，最后經0.25%胰酶消化，逐次傳至第三代后可獲得大量的脂肪干細胞系[7-9]。另外，目前尚未研究出鑒定ADSCs的特異性表面標記，主要參照相關的基質細胞及干細胞的特異性標記物進行鑒別。綜合以往研究結果發現，ADSCs主要表達CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90、CD105、CD146、CD166、SH-3等，不表達CD31、CD34、CD45、HLA-DR，其中對于CD34的表達尚存在爭議[10-13]。然而，有研究表明以上這些標記物的表達會因ADSCs獲取的部位，供體種類，手術類型，細胞密度及傳代次數的不同而具有差異性[14,15]。因此，只憑某些CD分子的表達來鑒定ADSCs是無可信性的，鑒定ADSCs最可行性的方法是進行多系定向誘導分化，檢測分化細胞的相應指標，若誘導成功則可間接證實ADSCs具有干細胞特性。如ADSCs向平滑肌分化的潛能可以根據誘導后細胞的形態及特異性標記物來鑒定。若細胞形態由成纖維樣變成紡錘狀肌束，且α-平滑肌肌動蛋白、肌鈣蛋白及肌球蛋白重鏈表達呈陽性，表明ADSCs已成功誘導分化為向平滑肌細胞[16]。
2ADSCs在泌尿系統疾病中的應用
2.1急性腎損傷
急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)是一類發病率和死亡率都很高的腎臟疾病，目前臨床上最主要的治療手段是血液透析和腎移植，而前者只能短暫的代替腎臟的一部分功能，后者最大的挑戰是腎源短缺。干細胞移植的研究為腎臟疾病的治療提供了全新的思路和方法。Li等人[3]將人的脂肪干細胞（humanadipose-derivedstemcells，hADSCs）經尾靜脈注入至缺血再灌注腎損傷模型的C57BL/6小鼠體內，發現在損傷早期hADSCs即可遷徙至小鼠腎臟，并分化成腎小管上皮細胞，這些分化的細胞逐漸增殖取代死亡的腎臟細胞，這說明，hADSCs有效維持了腎臟結構的完整性和后續的組織修復過程。然而，另有研究表明，經小鼠尾靜脈注射后，ADSCs進入血液循環后主要歸巢至肺臟，并非受損的腎臟，并且，在手術當天和術后前兩天持續尾靜脈注射，可有效減輕腎小管上皮細胞壞死及間質炎性細胞浸潤的程度[17]。為提高干細胞在腎臟內的歸巢效率，Lee等人[18]采用腎內動脈直接注射法，使誘導的干細胞直接進入受損腎臟，結果顯示，臨近干細胞周圍的腎小管上皮細胞凋亡率明顯減少，這意味著腎內動脈直接注射可有效增加移植細胞的數目。但該注射法必須借助導尿術和血管造影術或X線才能順利操作。綜上所述，靜脈注射雖操作簡單、創傷性小，但干細胞向腎臟的歸巢數目較少；而腎內動脈直接注射雖能提高干細胞歸巢量，但操作較難，創傷性大，并且兩種方法中干細胞存活率都很低。針對這一難題，Gao等人[4]首次將ADSCs與組織工程材料--溫敏性氯化殼聚糖（chitosanchloride，CSCI）水凝膠相結合，以CSCI水凝膠為載體，直接將ADSCs注射至AKI腎臟皮質之內，結果發現，ADSCs復合CSCI水凝膠共同注射移植不僅能夠改善ADSCs在腎臟內的滯留和存活，還可以顯著增加微血管密度，進而促進腎小管的修復和再生，而且4周后注射部位CSCI水凝膠為HE染色陰性，這說明CSCI水凝膠具有良好的組織相容性和生物降解性。因此，利用組織工程材料作為ADSCs的細胞載體在很大程度上解決了移植細胞低滯留低存活的難題，在AKI疾病治療中具有廣闊的應用前景。
2.2輸尿管損傷
輸尿管損傷最常見的誘因為醫源性和外傷性，損傷所致的并發癥主要表現為輸尿管狹窄、缺損，尿外滲及尿路梗阻等。若輸尿管缺損程度較小，可采用輸尿管斷端吻合術或輸尿管膀胱吻合術等手術方法進行治療和修復。而輸尿管缺損程度較大或伴隨嚴重并發癥者，通常需要進行輸尿管代替。目前最常用的輸尿管代替物為胃腸道，腸代輸尿管法雖然解決了輸尿管缺損和尿外滲，但容易引起腸粘連，慢性感染及尿結石等并發癥[19]。對此，輸尿管組織工程學逐漸成為國內外研究的熱點。Zhao等人[20]首次將ADSCs與生物材料相結合用于輸尿管組織重建，他們首先將兔來源的ADSCs誘導分化成平滑肌細胞（smoothmusclecells,SMCs），然后將SMCs接種至血管細胞外基質（Vesselextracellularmatrix,VECM）支架的表面，共培養1周后，將攜帶SMCs的VECM移植到尿路缺損的新西蘭白兔動物模型中，16周后取材發現移植處形成復層上皮組織肌束，并且靜脈尿路造影未發現輸尿管狹窄和腎積水并發癥。而后有研究相繼報道了一種新型的人工-天然復合型支架材料，該研究以聚乳酸（polylactideacid，PLA）為原料制作輸尿管螺旋形支架的內層，以PLA/I型膠原為混合材料制作支架的外層，利用Transwell間接共培養系統誘導hADSCs定向分化為尿路上皮細胞并將其種植于PLA/I型膠原支架的外層后一并植入裸鼠背部皮下組織內，成功構建了輸尿管支架皮下植入的動物模型。種植兩周后取材，結果顯示植入后無動物死亡、無炎癥及感染發生，誘導后的hADSCs能浸潤至支架的內部并能表達尿路上皮細胞的標志物[5]。以上研究給我們兩點提示：第一，ADSCs可作為理想的種子細胞應用于組織工程學；第二，PLA/I型膠原混合型三維新型支架具有良好的生物相容性。相關研究初步證實了ADSCs復合新型支架材料構建的組織工程化輸尿管用以體內原位替代的方法是可行的。
2.3下尿路疾病
近年來，各種原因（年齡，糖尿病，肥胖，外傷等）導致的下尿路疾病的發病率越來越高。下尿路功能障礙雖然不能構成生命威脅，但嚴重降低了患者的生活質量，傳統的治療方法依舊會存在不同程度的缺陷和并發癥[21]。干細胞結合組織工程技術在下尿路修復重建中的應用逐漸成為臨床治療的新策略。近些年，許多研究顯示ADSCs在膀胱及尿道重建的研究中已取得了初步性的進展，主要以膀胱缺損，神經源性膀胱，壓力性尿失禁及尿道缺損等下尿路疾病為研究熱點。ADSCs誘導分化成平滑肌細胞和尿路上皮細胞的潛能已被證實[6,22]，這些證據為其在下尿路重建中的應用提供了可行性。Huang等人[23]將ADSCs直接注入至高脂血癥大鼠動物模型的膀胱體內，結果發現ADSCs注射組血清總膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著降低，并伴有血管和神經密度的增加及排尿頻率的減少。這說明，ADSCs可用于改善高脂血癥引起的膀胱過度綜合征尿急尿頻的癥狀。此外，ADSCs的這種作用在糖尿病膀胱功能障礙的2型糖尿病大鼠模型中也得到證實[24]。近年來，隨著干細胞和組織工程技術的發展，ADSCs復合組織工程支架材料在膀胱及尿道修復重建中的應用已陸續被報道，而且，相比之下發現支架材料TEPS（Tissue-engineeredprepucescaffold）可增強ADSCs的抗纖維化作用，減少組織化器官纖維瘢痕的形成[25-29]。另外，Yamamoto實驗室首次對兩例壓力尿失禁患者進行自體ADSCs移植注射治療，他們將處理過的患者自體ADSCs經尿道注射至尿道括約肌和黏膜下層，經過12周的術后觀察發現患者尿失禁的次數明顯減少，超聲波顯示尿道血流量顯著增加，并且患者術后未出現明顯的不良反應[30]。這一結果初步表明，經尿道注射自體ADSCs可成為臨床上治療壓力性尿失禁安全可行的手術方法，實現了自體ADSCs移植從動物模型到臨床治療的成功過渡。
3ADSCs治療泌尿系統疾病的可能機制
盡管ADSCs的相關報道越來越多，但仍然不能確定AD-SCs在泌尿系統疾病中的具體修復機制。ADSCs發揮修復作用的機制既可能為ADSCs多潛能分化，也可能是其自身的旁分泌作用，目前為止兩方面都有證據支持。當前普遍認為ADSCs可誘導分化與泌尿性器官相關的多種細胞，如平滑肌細胞及尿路上皮細胞等密切聯系，這些來源于ADSCs的細胞逐漸增殖取代死細胞留下的空隙而達到器官修復的作用[3,31-32]。然而，Rehman等人用不含生長因子的5%FBS基礎培養基培養hAD-SCs，72h后發現hADSCs自身能夠分泌大量的血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、肝細胞生長因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、少量的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF）及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。在低氧環境刺激下，這些生物活性因子的含量明顯增加，其中VEGF增加五倍之多，VEGF含量的增加可明顯改善hADSCs移植后血管生成的狀態。這意味著，hADSCs可通過調控自身旁分泌效應來應對外界刺激[33]。另有研究發現，ADSCs移植后可通過抗氧化及抗炎性反應特性發揮抗細胞凋亡作用，并能促進腎小管細胞的增殖，從而緩解大鼠急性缺血性腎損傷的癥狀[34]。以上結果提示我們：將ADSCs或其它干細胞過表達某些生物活性因子后是否能提高干細胞移植后的治療效果。Song等人建立了HGF過表達的骨髓間充質干細胞系，并將其種植到膀胱出口梗阻（Bladderoutletob-struction,BOO）模型的大鼠體內，結果發現過表達HGF后可顯著減少膀胱內膠原沉積[35]，這說明，干細胞過表達HGF后移植可成為膀胱纖維化疾病治療的新策略。雖然體外過表達在一定程度上能提高干細胞的移植效果，但是需要我們考慮的問題還很多，比如選擇的載體是否具有較高的轉導效率；怎樣確保載體能夠長期穩定的在體內表達以及移植后的載體是否會影響宿主細胞的活力等。這些問題的探索和解決將有助于ADSCs在泌尿系統疾病中的臨床應用。
4結語
綜上所述，ADSCs具有來源廣，易獲得，誘導分化能力強，病人痛苦小、易接受等諸多優點，已成為組織工程中理想的種子來源，并在腎臟修復、輸尿管及下尿路重建中取得了初步性進展，而ADSCs復合支架材料共移植進一步解決了單純支架移植后導致的支架吸收和攣縮。雖然ADSCs在泌尿系統疾病基礎研究中取得了很大的進展，但ADSCs誘導分化及移植最終要過渡到人體內進行研究，而目前對ADSCs的研究仍處于動物試驗階段，并且ADSCs向泌尿系統靶器官的分化機制及其復雜的旁分泌效應依舊處在探索階段，距臨床應用還存在一定的差距，這些問題的解決將有助于我們對ADSCs的研究更加清晰和完整，為泌尿系統組織工程技術在臨床應用中帶來新的思路和突破。
作者：董孜璞 修有成 趙維明 劉贊 金承俊 夏舜堯 單位：哈爾濱醫科大學附屬第一醫院泌尿外科