豬流感病毒檢測(cè)ELISA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用
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摘要：生豬養(yǎng)殖過程中，豬流感疾病是危害生豬養(yǎng)殖健康狀況和生產(chǎn)性能的常見疾病，給生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的科學(xué)發(fā)展帶來了巨大的阻礙。豬流感是由豬流感病毒所導(dǎo)致的一種傳染性強(qiáng)、傳播迅速、較難根治的一種呼吸道疾病?，F(xiàn)階段通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試驗(yàn)（elisa）可以快速有效地了解豬流感的發(fā)病和流行情況，并進(jìn)行科學(xué)的診斷和治療。ELISA檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及試驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，給生豬疾病檢疫人員帶來了很大的便利。本文對(duì)ELISA檢測(cè)技術(shù)及其在豬流感病毒檢測(cè)上的應(yīng)用進(jìn)行介紹，旨在為科學(xué)推廣ELISA檢測(cè)技術(shù)以及生豬的健康養(yǎng)殖帶來幫助。
關(guān)鍵詞：ELISA檢測(cè)技術(shù)；豬流感；病毒檢測(cè)；應(yīng)用措施；健康養(yǎng)殖
豬流感是由流感病毒所引起的，在生豬養(yǎng)殖過程中一種常見的急性、傳染性呼吸道疾病，對(duì)于生豬養(yǎng)殖的健康水平以及生產(chǎn)性能均有非常大的負(fù)面影響。自從本世紀(jì)初的甲型H1N1流感在畜牧養(yǎng)殖中大肆蔓延之后，對(duì)于流感病毒的檢測(cè)方法開始逐漸受到人們的重視?，F(xiàn)階段主要的流感病毒檢測(cè)方法有血清學(xué)診斷方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法、量子點(diǎn)生物探針流式免疫技術(shù)以及液相芯片技術(shù)等，其中血清學(xué)檢測(cè)方法中的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）是當(dāng)前流感病毒檢測(cè)中最常用的方法之一，ELISA檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)以及試驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，給生豬疾病診斷帶來了很大的便利。
1ELISA檢測(cè)技術(shù)的基本原理
ELISA檢測(cè)技術(shù)早在上世紀(jì)70年代開始應(yīng)用，主要是通過抗原定位酶標(biāo)抗體的方式進(jìn)行應(yīng)用，成為一種測(cè)定液體中微量物質(zhì)的新技術(shù)。ELISA檢測(cè)技術(shù)的原理主要是通過具有免疫活性的抗原或者抗體通過包被在固態(tài)的某種載體上，通過將包被的載體與相應(yīng)的樣品相結(jié)合形成一種具有免疫活性或酶活性的酶標(biāo)抗原或者抗體物質(zhì)，再將其與這些具有酶活性的酶標(biāo)抗原或者抗體物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)后形成結(jié)合的復(fù)合物，通過下一步的洗滌去除雜質(zhì)后，通過添加底物以及酶形成呈色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀定量或者定性分析，從而進(jìn)行樣品中物質(zhì)的檢測(cè)[1]。
2ELISA檢測(cè)技術(shù)的分類
ELISA檢測(cè)技術(shù)按照不同的檢測(cè)目的以及方法進(jìn)行不同的分類，ELISA檢測(cè)技術(shù)可以用于檢測(cè)抗原或者抗體，以及固相的抗原或者抗體免疫吸附劑、酶標(biāo)記的抗原或者抗體結(jié)合物等。不同的ELISA檢測(cè)技術(shù)中酶反應(yīng)底物是所必須的試劑，通過根據(jù)ELISA檢測(cè)技術(shù)中試劑之間的結(jié)合方式進(jìn)行了不同的分類，主要的ELISA檢測(cè)技術(shù)分類有ELISA直接檢測(cè)法、ELISA間接檢測(cè)法、ELISA雙抗夾心檢測(cè)法、ELISA捕獲檢測(cè)法、ELISA競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法等[2]。
3ELISA檢測(cè)技術(shù)在豬流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用
ELISA在豬流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用主要是通過依靠豬流感病毒純化蛋白作為檢測(cè)抗原或者抗體，血凝素（HA）作為豬流感病毒主要的表面抗原，是由HA1蛋白和HA2蛋白所組成，其中HA1是高度進(jìn)化的抗原或者抗體的結(jié)合區(qū)域，而HA2相對(duì)而言較為保守，核蛋白NP同HA2蛋白相同也較為保守。在豬流感病毒檢測(cè)的ELISA檢測(cè)技術(shù)中通常有ELISA間接檢測(cè)法、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法、捕獲法抗原ELISA檢測(cè)等。
3.1ELISA間接檢測(cè)法
ELISA間接檢測(cè)法主要是通過利用酶標(biāo)記的抗體來檢測(cè)與固相載體上抗原所結(jié)合的待測(cè)抗體的檢測(cè)方式，ELISA間接檢測(cè)的方法不但可以有效檢測(cè)出豬流感病毒機(jī)體抗體水平，還可以準(zhǔn)確的區(qū)分豬流感疫苗免疫抗體和各種豬流感亞型野毒感染所產(chǎn)生的機(jī)體抗體。現(xiàn)階段通過利用H1亞型豬流感病毒的HA1純化蛋白作為識(shí)別抗原，建立了科學(xué)有效的豬流感病毒ELISA間接檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)血清中的豬流感病毒抗體的陽性符合率可以達(dá)到85%～95%左右，通過利用H3亞型的流感病毒中的HA和HA1蛋白，將其純化后使用單克隆抗體作為包被的抗原建立了ELISA間接檢測(cè)的方法，對(duì)于血清中豬流感病毒的檢出率達(dá)到86%～93%左右[3]。有研究學(xué)者通過使用H5亞型的豬流感病毒，以HA1重組蛋白為基礎(chǔ)建立ELISA間接檢測(cè)的方法，在患病動(dòng)物血清中豬流感病毒準(zhǔn)確檢出率達(dá)到94%左右。通過利用H1、H3以及H9的亞型豬流感病毒建立基于M2蛋白多肽抗原的間接ELISA檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)可以有效檢測(cè)出血清中多種流感病毒亞型的抗體，準(zhǔn)確率可以達(dá)到98%以上。間接ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于與包被抗原反應(yīng)的抗體是不加酶的抗體，該抗體有效保留較高的免疫活性，通過酶標(biāo)記的另一個(gè)二抗抗體可以有效的加強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)，間接ELISA檢測(cè)方法的缺點(diǎn)在于出現(xiàn)交叉反應(yīng)的可能性比較高[4]。
3.2雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法
雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法是通過將已知的抗體吸附到固相載體上后，將待測(cè)的抗原與吸附于固相載體的抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)記的二抗相結(jié)合的方法，這種檢測(cè)方式適用于具有至少雙表位的抗原。研究學(xué)者通過使用H1亞型的豬流感病毒中HA單克隆抗體，初步建立的豬流感病毒的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)血清樣本中陽性樣本的符合率達(dá)到96%左右。通過利用H9亞型流感病毒的高免血清中的IgG作為包被抗體，再使用抗AIV-NP-7B4單克隆抗體作為雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的二抗，成功建立了豬流感病毒抗原的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確迅速的檢出患病動(dòng)物血清中H9亞型豬流感致病性病毒。雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于高度的靈敏性和專一性，同時(shí)抗原檢測(cè)過程不需要純化，雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的缺點(diǎn)是此方法不適用于小分子半抗原的病毒檢測(cè)，同時(shí)待檢測(cè)的抗原需要擁有至少兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位[5]。
4結(jié)束語
ELISA檢測(cè)技術(shù)具有高度的靈敏性以及較強(qiáng)的特異性，同時(shí)具有操作方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較低、檢測(cè)造成的污染較小以及所需儀器設(shè)備常見、便宜等優(yōu)勢(shì)，該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)缺點(diǎn)有抗原制備純度，抗體制備的含量和純度要求較高、較復(fù)雜和困難。另外ELISA技術(shù)應(yīng)用于單克隆抗體的篩選、活性的測(cè)定以及制備純化是大海撈針的工作量，也是制約ELISA檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要瓶頸。未來將通過其他高端技術(shù)，精密儀器在ELISA技術(shù)中的發(fā)展和應(yīng)用，將不斷提升ELISA技術(shù)在動(dòng)物疫病和人類疾病監(jiān)測(cè)和診斷中的應(yīng)用，將會(huì)是未來檢測(cè)中不可取代的一項(xiàng)重要技術(shù)和手段。
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作者：郝衛(wèi)芳 單位：山西省太原市動(dòng)物預(yù)防控制中心