再生醫(yī)學論文：再生醫(yī)學在陰道成形術中的運用
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本文作者：伊家嘉、夏煒、姚明 單位：寧夏醫(yī)科大學、西京醫(yī)院整形外科研究所、寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院燒傷整形科
陰道組織工程中的種子細胞
頰粘膜：Lin[3]成功地應用自體頰粘膜為8例患有MRKH綜合征的患者進行了陰道再造術。取出2cm×7cm的自體全厚頰粘膜片，在粘膜片上打針孔樣的洞以增加移植物的面積，將其固定在陰道處造的腔穴中，粘膜片邊緣與小陰唇及周圍皮膚縫合，放入模具。這是首例應用自體頰粘膜進行的陰道再造術。Oakes等[4]首次用自體頰粘膜片對一位曾行結腸陰道再造術后繼發(fā)狹窄的患者進行了二次陰道成形術獲得成功，證明頰粘膜是陰道再造的良好材料。這為頰粘膜作為種子細胞應用于組織工程陰道再造提供了思路。趙穆欣等[5]也應用自體頰粘膜微粒移植進行了陰道再造。他將頰粘膜剪成0.5mm的微粒并移入尿道與直腸之間造的腔穴中。術后陰道深6～10cm，容納兩指寬，人造陰道粉紅色，表面光滑，組織病理學示未角化的復層扁平上皮粘膜層，供區(qū)愈合良好。利用自體頰粘膜進行陰道再造術為自體頰粘膜作為種子細胞應用于陰道組織工程奠定了基礎。李森愷等［6］用口腔粘膜微粒進行陰道重建，口腔粘膜微粒是補充粘膜缺損的良好材料，成活容易，生長迅速，術后收縮較小，可以應用于部分尿道重建和陰道重建等被覆粘膜結構器官的再造。他采用明膠海綿承托口腔粘膜微粒游離移植的方法行陰道再造術。點狀采取直徑為5mm口腔粘膜片剪成直徑小于1mm的微粒備用。口腔創(chuàng)面填塞碘仿紗條放置。將獲取的粘膜微粒均勻地涂在干燥的明膠海綿上。陰道再造時，陰道諸壁各用1片明膠海綿承托的粘膜微粒覆蓋。多孔硅膠模具中填塞碘仿砂條固定。采用這種方法，陰道深6～10cm，寬能容窺具，粘膜光滑紅潤，彈性好，近陰道外口陰道壁可見皺襞，病理示復層鱗狀上皮，外陰外觀與正常女性相似，無任何手術痕跡。口腔內供粘膜區(qū)域無繼發(fā)畸形，張口不受限，感覺正常[7]。頰粘膜取材方便，供區(qū)范圍較廣，創(chuàng)傷小，風險低，不留并發(fā)癥或繼發(fā)病理改變，組織學形態(tài)與正常陰道粘膜相似且組織相容性好，是組織工程應用于陰道再造的良好種子細胞。
上皮細胞及平滑肌細胞：Roger［8］將體外培養(yǎng)的兔陰道上皮細胞和平滑肌細胞分別種植于PGA支架的內外兩面，植入裸鼠皮下繼續(xù)培育，免疫組化染色顯示所形成的工程化組織中上皮細胞角化蛋白AE1／AE3抗體及SM-o-actin抗體陽性，其染色的形態(tài)和強度與正常陰道組織相似，植入人體內6周后呈現(xiàn)顯著的層次結構。同時觀察到受體血管浸潤現(xiàn)象，還可見平滑肌細胞呈現(xiàn)肌束樣結構，而未種植細胞的對照組支架毫無組織形成的跡象。此外，該組織表現(xiàn)出與正常陰道組織相似的對電刺激產(chǎn)生特有的收縮反應且振幅相似。提示其與正常陰道組織表型、組織學和功能相似，然而研究表明陰道粘膜上皮細胞和平滑肌細胞在體外增殖能力有限。多次傳代后細胞易老化，因而不甚理想。陰道粘膜細胞:Pierluigi等［9］首次將自體陰道組織移植用于Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser綜合征(MRKHS)患者的陰道再造。他在患者的陰道前庭取出1cm2的粘膜全層用酶消化后涂于IV型膠原支架上培養(yǎng)，2周后患者行改良的Abbe-McIndoe陰道成形術并將體外培養(yǎng)的324cm2自體陰道組織覆蓋于陰道壁上。術后1個月，陰道的深度和寬度與正常陰道相似。用自體陰道前庭作為種子細胞的供區(qū)，患者損傷小，不留永久性瘢痕，避免異體組織移植發(fā)生排斥和感染的可能性；但供區(qū)有限，遠期效果不詳。人陰道成纖維細胞:人陰道成纖維細胞（HumanVaginalFibroblasts,HVFs）的優(yōu)點在于容易獲取并進行體外培養(yǎng)和擴增。Man等[10]發(fā)現(xiàn)HVFs進行2、3次傳代后獲得的細胞依然具有與同源細胞相同的典型形態(tài)。用傳代HVFs作為種子細胞用于組織工程制造筋膜替代物來填補缺陷組織,支持懸浮器官，如陰道再造，盆腔器官脫垂等。
骨髓干細胞:骨髓干細胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMMSCs）向粘膜上皮細胞分化迄今已有較多文獻報道，體外誘導BMMSCs分化為口腔、氣道、胃腸道、輸尿管等粘膜上皮細胞。在體內亦可分化為粘膜上皮細胞，參與粘膜炎癥等損傷后的修復。Visaget[11]將人BMMSCs與人支氣管上皮細胞共培養(yǎng)一段時間后,前者形態(tài)改變呈上皮細胞樣的立方形并具有纖毛樣的附屬結構，間接證明了BMMSCs可用于陰道組織工程的可行性,構建組織工程化陰道所需的粘膜上皮細胞和平滑肌細胞理論上可由BMMSCs分化而來，可用于陰道組織工程的支架材料有聚羥基乙酸（polyglycolide,PGA）、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolicacid,PLGA）、小腸粘膜下層(SmallIntestinalSubmucosa,SIS)等，已有較多文獻報道BMMSCs在這些支架材料上粘附牢靠，增殖旺盛。這些均提示BMMSCs可用作陰道組織工程的種子細胞［12］。然而BMMSCs取材較少，成功的誘導分化為上皮細胞和平滑肌細胞并大量增殖及粘附的技術有限，尚需進一步研究。脂肪干細胞:Brzoska[13]發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸能夠誘導脂肪干細胞（adiposederivedstemcells,ADSC）向上皮系分化。Altman等［14-15］首次成功地將ADSC種植于脫細胞真皮基質（acellulardermalmatrix，ADM）上，ADSC可以輕松地從皮下脂肪中獲得，手術損傷小，痛苦少，操作簡便。Hakan［16］將含有ADSC的脫細胞真皮和不含ADSC的脫細胞真皮植入Fischer大鼠皮下。8周后，含有ADSC的脫細胞真皮的厚度和血管密度及膠原含量明顯高于未種植ADSC的脫細胞真皮。ADSC可以粘附于ADM上，它降低了移植物體內吸收率，具有更好的穩(wěn)定性和持久性，改善ADM的種植效果。Nie［17］猜測在ADM上植入ADSC可通過旁分泌血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、轉化生長因子b（transforminggrowthfactor,TGFb）、胰島素樣生長因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)和人類生長因子(humangrowthfactor,HGF)有效地促進傷口愈合。Kim等［18-19］的實驗記錄表明ADSC可以刺激成纖維細胞分泌膠原蛋白。任何無血管的有機材料盡管有些是自體的，它們也會因為缺乏營養(yǎng)和活性減退而在移植部位出現(xiàn)吸收的可能。所以有機移植材料的早期血管化和營養(yǎng)支持格外重要，可降低其吸收率。ADSC分泌的VEGF可促進早期血管化，提供營養(yǎng)，預防ADM吸收，因此，ADM是ADSC的良好支架，它具有抗感染，免疫豁免，可快速植入受區(qū)等特點，還可以用于腹部筋膜缺陷的治療，腭裂修補術和粘膜替代物。本實驗可為陰道再造和預防術后狹窄及攣縮提供思路。陰道粘膜干細胞:陰道粘膜干細胞（vaginalmucosastemcells,VMSC）存在于陰道粘膜上皮的基底層，具有高度的自我更新能力，在維持粘膜上皮細胞再生和修復方面具有重要功能。王沂峰等［20］用VMSC作為種子細胞種植于人羊膜上，VMSC在負載物上能良好地生長，形成一層具有組織形態(tài)的薄膜，移入制備的無陰道小鼠體內，可用于修復缺損。然而陰道粘膜干細胞取材有限，是否能大量增殖替代陰道粘膜有待研究。
陰道組織工程中的基質材料
脫細胞真皮:同種異體脫細胞真皮基質（acellulardermalmatrixallograft,ADMA）采用特殊工藝去除表皮中引起排異反應的細胞成分，而保留了基底膜、細胞外基質等骨架結構，因此具有低免疫原性、不易吸收、易塑形等特點。廣泛應用于燒傷、口腔、耳鼻喉、整形等學科領域。陰道瘺修補術中應用ADMA不僅起到填補陰道內壁、加強支持作用，也能允許新生粘膜組織的無瘢痕愈合[21]。RENOV補片是應用組織工程學技術，將異體組織通過脫細胞處理后得到的一種天然的細胞外基質，保留了細胞外基質成分及三維空間框架結構，是一種真皮替代品。2006年，朱蘭等[22]用RENOV醫(yī)用組織補片為5例患者行人工陰道成形術，術后第8周隨訪見人工陰道全長均已完全粘膜化。2009年，他們用組織工程醫(yī)用生物補片對小型實驗豬行陰道重建術，術后12周，陰道粘膜上皮細胞、平滑肌細胞及對電刺激的收縮反應均與正常陰道相似[23]。人造真皮是一種由纖維端膠原和熱變性端膠原組成的膠原海綿，植入活體內，宿主的上皮細胞和成纖維細胞就會長入這種膠原材料內并逐漸被宿主組織替代，最后形成了真皮樣組織。人重組堿性成纖維細胞生長因子（bfibroblastgrowthfactor,bFGF）可以促進神經(jīng)外胚層和中胚層的增殖及分化如上皮細胞和成纖維細胞，它們在組織再生和肉芽組織形成中起重要作用。人重組bFGF可以縮短創(chuàng)傷愈合時間，在Ⅱ度燒傷中加快上皮化，促進肉芽組織形成[24]。基于上述特點，Soichi等[24]用一種人造真皮(端膠原海綿)進行了陰道成形術。他將這種人造真皮固定在模具上，然后放進預先造好的陰道穴中固定。術后第10天，向患者陰道內噴灑人重組bFGF加快其上皮化直到第19天，可見陰道內有一薄層上皮樣的細胞覆蓋伴新生毛細血管形成，1/4的陰道粘膜完全上皮化類似正常陰道。術后50天，組織病理學示陰道完全被復層扁平上皮覆蓋，表面光滑。Hakan等[16]將含有脂肪干細胞的脫細胞真皮植入Fischer大鼠皮下，為探索組織工程用于腹部筋膜缺陷、腭裂修補術、粘膜替代物的材料也取得了良好效果。
聚羥基乙酸（polyglycolide,PGA）:Roger等[8]將雌兔的陰道上皮細胞和平滑肌細胞培養(yǎng)擴增后種植到PGA支架上，植入裸鼠皮下探索陰道上皮細胞和平滑肌細胞在體內陰道組織工程中的應用。體外迅速擴增能力和細胞的正常表型無受損是種子細胞成功地進行組織工程的理想狀態(tài)。成功地將體外培養(yǎng)的活細胞隨同支架移入宿主體內是組織工程中最重要的環(huán)節(jié)之一。PGA便于制成各種三維結構，并且有很好的支持和轉運細胞的能力，因此被廣泛應用于組織工程。Roger將陰道上皮細胞和平滑肌成功地在PGA兩側共培養(yǎng)。免疫細胞化學和western印記分析表明移入體內并穩(wěn)定生長的確是陰道上皮細胞和平滑肌細胞。在空間上，PGA上的陰道上皮細胞和平滑肌細胞隨著時間的推移出現(xiàn)明顯的分層生長。這些發(fā)現(xiàn)表明陰道上皮細胞和平滑肌細胞可以在體內長時間存活、復制并朝正常的陰道結構生長。在功能方面，組織工程陰道在受到電脈沖刺激后可以與正常天然陰道產(chǎn)生相似的收縮力，這說明細胞具有完整的膜系統(tǒng)，可以釋放陽離子，進行去極化并發(fā)生肌肉收縮，但是它在復極化中與天然陰道有所區(qū)別。組織工程陰道對乙酰膽堿和去甲腎上腺素的化學刺激無反應。這說明神經(jīng)遞質受體難以合成。這是首次將組織工程應用于體內進行陰道再造。培養(yǎng)的上皮細胞和平滑肌細胞可以保持正常的形態(tài)并大量增殖進行組織替代。含有細胞的支架可以血管化并表現(xiàn)出與天然陰道相似的結構和功能。
膠原蛋白:膠原蛋白生物相容性好，降解速度可調。而且可參與組織修復，是一類優(yōu)良的可引導組織再生的生物材料。I型膠原作為體外細胞培養(yǎng)支架時可以促進細胞粘附和誘導生長分化，是良好的培養(yǎng)粘附劑。其降解產(chǎn)物可被細胞利用合成新的基質。不產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物，不影響內環(huán)境pH值，因此不會影響細胞的生長增殖。利用人脂肪干細胞作為種子細胞，體外將細胞種植于膠原支架上鏡下顯示，種子細胞種植膠原材料后，生長狀態(tài)良好，無明顯細胞毒性表現(xiàn)，在培養(yǎng)條件相對穩(wěn)定的情況下，細胞可以進行正常增殖、遷移并分泌細胞外基質。通過檢測，細胞與支架的粘附率達97%以上。說明該支架對細胞有良好的親和性[25]。Pierluigi等[9]將人自體陰道前庭粘膜細胞植入IV型膠原支架用于陰道成形術取得良好效果。Man等[10]將人陰道成纖維細胞（humanvaginalfibroblast,HVF）分別植入高比率I/III膠原支架和低比率I/III膠原支架植入小鼠皮下，結果證明高比率I/III膠原支架組的人陰道成纖維細胞增殖能力優(yōu)于低比率I/III膠原支架組，它可作為組織工程筋膜替代物治療盆腔器官脫垂和陰道再造等。然而膠原蛋白價格昂貴，降解快，機械強度較差[25]等缺點尚不足以作為組織工程陰道的良好材料。
明膠海綿:明膠（Gelatin,Gel）是由膠原的局部水解產(chǎn)物制備的可溶性蛋白質，它由膠原的三重螺旋結構解體為單分子而形成。膠原在生理條件下具有一定的抗原性，明膠則無抗原性，是組織工程生物材料制備的一種理想成分[26]。2009年，李森愷等[6]采用明膠海綿承托口腔粘膜微粒游離移植的方法行陰道再造術獲得成功。然而明膠存在的最高溫度為35℃，在較高溫度下解體，不適合37℃下長期使用[26]。
人羊膜(humanamnioticmemberane，HAM):Sarwar等[28]用羊膜瓣為28例患者做陰道再造術獲得成功。羊膜基底膜含有層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原及某些細胞生長因子如表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等，可促進細胞的粘附、生長及增殖。在組織工程方面，王沂峰等［20］將HAM進行脫細胞處理后，用細胞組織工程技術將VMSC種植在HAM的基質面上，觀察VMSC在HAM上的生長情況，為采用HAM負載VMSC構建陰道粘膜，治療先天性無陰道提供實驗依據(jù)。翁慧男等[29]通過體外分離、培養(yǎng)人VMSCs，種植于人羊膜上，首次成功地構建了人工陰道的小鼠模型。移植入裸鼠體內第42天，顯示VMSCs形成類似正常陰道的復層鱗狀上皮。但目前組織工程技術尚不完善，如：天然支架來源相對少，不易批量生產(chǎn)，有傳播疾病的可能；陰道粘膜干細胞培養(yǎng)及脫細胞技術的局限性等問題。
同源脫細胞基質：Joerg等[1]用同源脫細胞基質在小鼠體內做陰道成形術。這一研究旨在評估脫細胞基質在陰道成形術中的應用。移植物未發(fā)生排斥并獲得了理想的陰道長度。組織病理學示陰道上皮細胞，毛細血管，肌細胞樣細胞，雌激素受體進入移植物，這一發(fā)現(xiàn)表明陰道基質中的膠原蛋白/彈性蛋白在陰道形成中有積極作用，但也發(fā)生了移植物塌陷和攣縮。實驗表明使用組織特異性同源脫細胞基質移植物用作陰道成形在技術上是可行的。當使用非組織特異性膀胱脫細胞基質作為移植物用于陰道再造時結果不理想，但是人陰道同源脫細胞基質取材有限，無法大規(guī)模生產(chǎn)應用于臨床。
陰道組織工程中的動物模型
皮下移植:Roge等[8]將體外培養(yǎng)的兔陰道上皮細胞和平滑肌細胞分別種植于PGA支架的內外兩面。植入裸鼠皮下繼續(xù)培育。免疫組化染色顯示其形態(tài)和電刺激后收縮強度與正常陰道組織相似。Man-JungHung等[10]將人陰道成纖維細胞植入I/III膠原支架上并放入小鼠皮下，結果I/III膠原支架的人陰道成纖維細胞增殖情況良好，它可作為組織工程筋膜替代物進行陰道再造。Hakan等［16］將含有脂肪干細胞的脫細胞真皮植入Fischer大鼠皮下，脫細胞真皮的厚度和血管密度及膠原含量增多。大量實驗選擇皮下移植的動物模型并取得良好效果。
腔隙內移植:朱蘭等[23]用組織工程醫(yī)用生物補片對小型實驗豬行陰道重建術，術后3個月基本完成組織重建，陰道粘膜上皮細胞，平滑肌細胞及對電刺激的收縮反應均與正常陰道相似。Joerg等[1]用同源脫細胞基質在小鼠體內做陰道成形術，組織病理學示陰道上皮細胞，毛細血管，肌細胞樣細胞，雌激素受體進入移植物。為實驗動物行陰道再造術，在腔隙內植入組織工程材料也可獲得滿意效果，更接近臨床應用。
體外培養(yǎng):王沂峰等[20]體外培養(yǎng)小鼠陰道粘膜干細胞(vaginalmucousmembranestemcell，VMSC)，并采用細胞組織工程技術，將VMSC種植在HAM的基質面上，為采用HAM負載VMSC構建陰道粘膜，治療先天性無陰道提供實驗依據(jù)。李慶林等[27]體外培養(yǎng)的平滑肌細胞在小腸粘膜下層（smallintestinalsubmucosa，SIS）基質種植后，經(jīng)形態(tài)學及免疫組化檢測，平滑肌細胞能夠在基質上貼附、分化及增殖，故SIS可用作陰道組織工程材料。體外實驗易于操作和觀察，然而組織工程進行器官再造終究要用于人體，在體內復雜的環(huán)境下體外實驗的可靠性需進一步證實。
人造陰道中的平滑肌是否必需
強調平滑肌在人造陰道中的作用:朱蘭等[23]用組織工程醫(yī)用生物補片對小型實驗豬行陰道重建術，術后陰道粘膜上皮細胞，平滑肌細胞及對電刺激的收縮反應均與正常陰道相似。Roger等[8]將雌兔的陰道上皮細胞和平滑肌細胞培養(yǎng)擴增后種植到PGA支架上，植入裸鼠皮下。PGA上的陰道上皮細胞和平滑肌細胞隨著時間的推移出現(xiàn)明顯的分層生長，陰道在收到電脈沖刺激后可以與正常天然陰道產(chǎn)生相似的收縮力。Man-JungHung等[10]用陰道成纖維細胞作為種子細胞用于組織工程制造筋膜替代物來填補缺陷組織如陰道再造等。組織病理學示平滑肌細胞，成纖維細胞，肉芽組織和膠原形成。Joerg等[1]用同源脫細胞基質在小鼠體內做陰道成形術。組織病理學示陰道上皮細胞，毛細血管，肌細胞樣細胞，雌激素受體進入移植物。陰道平滑肌層較薄，使陰道壁易于擴張和收縮，它在陰道作為軟產(chǎn)道中起重要作用，而子宮缺如的患者行陰道再造術的主要目的在于解決性生活問題，陰道平滑肌在這一過程中的作用不大。
未強調平滑肌在人造陰道中的作用:王沂峰等[20]體外培養(yǎng)小鼠陰道粘膜干細胞(vaginalmucousmembranestemcell，VMSC)并將它種植在人羊膜HAM的基質面上，觀察到VMSC在HAM上的生長良好，形成一層具有組織形態(tài)的薄膜，移入制備的無陰道小鼠體內可用于修復缺損，未觀察平滑肌細胞。李森凱等［6］用口腔粘膜微粒進行陰道重建，他采用明膠海綿承托口腔粘膜微粒游離移植的方法行陰道再造術，并未強調平滑肌的植入。Lin[3]在應用自體頰粘膜進行了陰道再造術時也未強調平滑肌的重要性。Soichi等[24]用一種人造真皮(端膠原海綿)進行了陰道成形術。他將這種人造真皮固定在模具上，噴灑人重組bFGF加快其上皮化，可見陰道內有一薄層上皮樣的細胞覆蓋伴新生毛細血管，組織病理學示陰道完全被復層扁平上皮覆蓋，未示平滑肌的出現(xiàn)。Pierluigi等［9］取出陰道前庭粘膜培養(yǎng)后涂于IV型膠原支架上并覆蓋于人造陰道壁，只強調了上皮化的發(fā)生而未提及平滑肌。Meghan[30]在用頰粘膜修復陰道粘膜時也只強調了其上皮化而未說明平滑肌的情況。大量實驗并未強調平滑肌在人造陰道中的重要性。
