宮頸癌組織中的miR-126研究
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【摘要】目的研究miR-126在宮頸癌組織中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法收集宮頸癌組織標(biāo)本78例。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織及癌旁正常宮頸組織中mir-126的表達(dá)情況，并分析miR-126在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果miR-126在宮頸癌組織中的表達(dá)相對(duì)于癌旁正常宮頸組織中的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)。miR-126在宮頸癌組織中的高表達(dá)率與宮頸癌患者的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期明顯相關(guān)，即miR-126在低分化組的高表達(dá)率明顯低于高中分化組(P=0.013)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的高表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.005)，在Ⅲ~Ⅳ期組中的高表達(dá)率明顯低于Ⅰ~Ⅱ期(P=0.007)。而miR-126在宮頸癌組織中的高表達(dá)率在不同年齡、腫瘤大小、HPV感染患者組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論miR-126可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，檢測(cè)miR-126的在宮頸癌中的表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】MiR-126；宮頸癌；侵襲；轉(zhuǎn)移
microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)度為18~25nt的單鏈，非編碼小RNA分子，通過(guò)與靶基因3'非編碼區(qū)結(jié)合，從而特異性調(diào)控靶基因的表達(dá)，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的功能[1]。miRNAs是重要的調(diào)控因子，能調(diào)控細(xì)胞的增殖、分裂、分化、凋亡等過(guò)程。研究顯示miR-126在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并且類似于抑癌基因樣作用[2-4]。此外，miR-126在乳腺癌、成人T細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌以及惡性間皮瘤中低表達(dá)，并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[5-7]。研究顯示miR-126在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常宮頸組織，然而，目前尚無(wú)有關(guān)miR-126在宮頸癌中的臨床意義以及預(yù)后價(jià)值的研究報(bào)道。本次研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-126在宮頸癌組織與癌旁正常宮頸組織中的表達(dá)，探討miR-126與宮頸癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后等之間的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示宮頸癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找宮頸癌預(yù)后分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1資料與方法
1.1病例資料收集
2010年5月至2013年12月期間我院收治并確診為宮頸癌的患者78例，年齡26~72歲，平均(54±15)歲。所有宮頸癌患者術(shù)前均未行放化療等抗腫瘤治療。病理學(xué)分類按照宮頸癌FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)。病理診斷結(jié)果經(jīng)兩名以上病理學(xué)專家確診。所取正常宮頸組織距癌緣>5cm，HE染色證實(shí)為非癌組織。
1.2主要材料TRIZOLTMReagent購(gòu)自invitro-gen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；qRT-PCRmiRNADetectionKit購(gòu)自上海吉瑪公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3qRT-PCR稱取每個(gè)宮頸癌標(biāo)本和癌旁正常宮頸組織各適量，用液氮研磨法將上述各種組織磨成粉末，用Trizol法抽提組織中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA于-80°C保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增采用RealtimeqRTPCR實(shí)時(shí)定量試劑盒，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，其中包括TaqDNApolymerase(5U/μl)0.2μl，MiR-126primers(5μmol/L)0.4μl，2×SYBRMix10μl，miR-NA-126product2.0μl，滅菌蒸餾水7.4μl。循環(huán)體系為：95°C3min，95°C12s，62°C35s，72°C30s，一共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，所測(cè)定的miR-126的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1宮頸癌組織中miR-126表達(dá)水平的檢測(cè)提取宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中的總RNA，以U6snRNA為內(nèi)參。采用qRT-PCR法檢測(cè)宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中miR-126的表達(dá)水平。選取1例癌旁正常宮頸組織的miR-126的表達(dá)值為1，以2-△△Ct表示miR-126的表達(dá)水平，然后分析得到78例宮頸癌組織中miR-126的平均表達(dá)值為(0.703±0.036)，癌旁正常卵巢組織中miR-126的平均表達(dá)值為(1.526±0.065)，二者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
2.2宮頸癌組織中miR-126表達(dá)水平和臨床病理參數(shù)的關(guān)系本次研究以宮頸癌組織中miR-126表達(dá)值的中位數(shù)為臨界值，miR-126的表達(dá)值大于或等于中位數(shù)為高表達(dá)，少于中位數(shù)為低表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-126在78例宮頸癌患者中有51例低表達(dá)(65.38%)，27例高表達(dá)(34.62%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-126在宮頸癌組織中的高表達(dá)率與患者的性別、年齡、HPV感染、組織學(xué)類型以及腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)；而miR-126在宮頸癌組織中的高表達(dá)率與宮頸癌患者的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期明顯相關(guān)，即miR-126在低分化組的高表達(dá)率明顯低于高中分化組(P=0.013)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的高表達(dá)率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P=0.005)，在Ⅲ~Ⅳ期組中的高表達(dá)率明顯低于Ⅰ~Ⅱ期(P=0.007)。
3討論
宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括從正常宮頸上皮出現(xiàn)內(nèi)瘤變，再逐步轉(zhuǎn)化為侵襲性宮頸癌。近年來(lái)，由于婦科普查以及宮頸癌早期篩查的實(shí)施，宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡也趨于年輕化。目前治療宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)方案為手術(shù)加放化療，但是不同患者的臨床結(jié)局存在顯著差異，并且也難以預(yù)測(cè)。因此，了解宮頸癌發(fā)生的病因、分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)機(jī)制對(duì)患者的治療策略以及預(yù)后標(biāo)記物的鑒別具有重要意義。最近大量研究顯示，miRNAs在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且類似于癌基因或抑癌基因樣作用[8]。由于miRNAs在不同組織和疾病中的特異性表達(dá)模式以及廣泛的調(diào)控潛能，因此可作為診斷與預(yù)后生物標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)[9]。研究顯示，miR-126在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，并且通過(guò)調(diào)控VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[10]。此外，miR-126在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與胃癌的臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且通過(guò)靶向調(diào)控Crk在體內(nèi)外抑制胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[11]。Hamada等[12]研究顯示miR-126在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且通過(guò)靶向ADAM9b抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲，并且還可誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)化。上述研究均表明miR-126在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因樣作用。Yu等[13]研究顯示miR-126在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，并且還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物博來(lái)霉素的敏感性。本次研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)了miR-126在78例宮頸癌組織及癌旁正常宮頸組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-126在宮頸癌組織的表達(dá)相對(duì)比癌旁正常宮頸組織明顯下調(diào)，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-126在宮頸癌中的表達(dá)水平與宮頸癌患者的組織分化程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。綜上所述，miR-126在宮頸癌組織中的表達(dá)下調(diào)，且miR-126的表達(dá)狀態(tài)與宮頸癌患者的腫瘤分化程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些結(jié)果均提示了miR-126可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移過(guò)程，為miR-126成為宮頸癌臨床預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物以及治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
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作者：龍丹 劉伏香 周艷 梁云香 單位：中國(guó)人民解放軍一六九醫(yī)院婦產(chǎn)科