中醫藥研究的應用
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從生理功能來說，犬的生理功能與人類高度相似，犬ICH模型與人的ICH情況非常接近。從解剖結構來說，豬腦的解剖結構與人很相似、尤其是腦容積大、腦實質呈回狀、腦白質發達、模擬ICH情況更好，也比較理想。最近，一項關于高原ICH動物模型研究就以豬為對象，較好的模擬了高原ICH的情況［1］。從實驗效果來說，靈長類肯定是最理想的模型動物，可用于腦神經保護劑因子等臨床前藥物的安全性和有效性評估。但因其價格昂貴，來源少，不可能大規模用于實驗室研究?？v觀目前的ICH實驗研究，ICH動物模型還是采用嚙齒類動物較多，且目前已積累了大量實驗研究基礎資料。比較常見的是家兔和大鼠。家兔因基底節區相對發達，定位相對容易，且耳緣靜脈取血方便和出血后神經功能缺損明顯等特點，在研究ICH的實驗中也較常用。大鼠因價格低、體型小、容易管理和進行實驗性手術，是目前使用最廣泛的ICH模型動物，大鼠腦尾殼核屬基底節，是腦內最大核團，易于進行腦立體定位，是人類高血壓ICH最好發部位，目前大鼠ICH模型研究多定位于鼠腦尾殼核。每種動物模型都有其優缺點，但就目前查閱到有關中醫藥對ICH的治療作用的實驗研究95%都選擇了大鼠作為實驗用動物。
2中醫藥研究中常見的ICH模型的制備方法
目前中醫藥復方治療ICH的實驗研究很多，有關ICH動物模型的造模方法的文獻也很多，但歸納起來方法的選擇無外乎以下4種類型。腦內注血法、細菌膠原酶注入法、自發性ICH動物模型和微球囊充脹法，其中前2種造模方法因操作相對容易，外部條件易控制，成為目前在中醫和中藥研究中使用最多的模型，第3種ICH模型因與臨床發病相似，也有不少研究采用，第4種模型目前應用較少，但不管是那種類型，都無法完全模擬人的疾病狀態，而且造模過程手技要求都比較高，相對其他病種動物模型的制備較難掌握。
2.1腦內注血法
將自體動脈血或凝血塊接注入腦內直是最常用的ICH造模方法。該方法操作成功與否關鍵在于動脈血的采集與推注時間和注入速度的控制。方法初期是將血液通過穿刺針注入到模型鼠腦右側尾狀核，由于當時沒有考慮到血液本身對模型的影響和注射壓力變化等因素，模型的成功率較低。后來Yu等［2］采用了一種自制的雙套管進行2次注血、3次拔針的改良法制備出了一種兔腦基底神經節出血模型。這種方法操作過于繁瑣，但避免了血液沿針道反流的問題，目前國內許多中藥復方的藥理研究均采用在此方法基礎上改良的大鼠尾殼核雙套管注血法。不同的實驗室根據習慣采用的自體血的采血部位各不相同。Nath等［3］介紹了從大鼠一側股動脈插管抽取新鮮未肝素化自體動脈血。李慧等［4］用微量注射器在一側股動脈抽取50μl動脈血，注血后留針20min，以避免血液自針道反流。郭松韜和吳喜［5］從大鼠心室腔內抽取血液。劉勝達等［6］以大鼠尾末端血代替股動脈取血，在2.5min內完成注入，留針5min。從查閱的文獻看取血部位除了上述部位還有內眥取血和舌下靜脈取血等。每種方法均有優缺點，如內眥取血量較準確，但成功率低;斷尾取血易造成混動靜脈血混血，同時采血量不易控制;心臟穿刺取血具有時間短、不凝血和簡便易行等優點，但技術要求高，穿刺定位須準確且不能反復穿刺。注血方式也在不斷改進，呂田明等［7］向尾殼核內2次注射不凝固自體動脈血。夏鷹等［8］采用大鼠尾動脈插管抽取新鮮自體動脈血分3次注入尾殼核。該方法的優點是:出血量可人為控制，觀察血液凝固過程中局部腦組織的循環異常及血管活性物質釋放物的病理生理學作用［9］。該法形成的血腫形態與出血量沒有直接關系，若注血速度過快，血液容易沿針道反流，因注射帶來的壓力過大易脹裂腦組織使血液流入腦室，造成血腫形態和大小的重復性較差。為了避免血液沿針道反流，呂田明和陸兵勛［10］提出采用凝固血進行造模。實驗使用靜脈留置針取血并待其凝固后，使用腦立體定位儀凝固的血液注入尾狀核中。該模型血腫規則，占位情況明顯，在血腫周圍有水腫及血液循環障礙等形成。但造模過程中發現由于血液凝固后容易析出血清，血清會沿針道反流，給操作帶來麻煩，所以在操作上要求快速注入(速度為20μl/min)。本實驗室一直從事抗ICH中藥復方的作用機制研究，結合文獻方法，通過反復實踐，采用鼠尾動脈取血，使用留置針分2次進行尾殼核注入的方法進行實驗研究，結果表明模型動物的死亡率相對較低，成模率和重復性均較好。并且與ICH臨床的發病過程類似性高，對藥物作用的機制研究較合適。
2.2注入膠原酶法
膠原酶是一種能特異降解間質和基底膜膠原的蛋白分解酶。當腦內注入膠原酶20min后，腦血管基底膜上的膠原蛋白即被破壞，進一步損傷血腦屏障，引起血管滲血，約4h出血區融合成片，膠原酶注入量的決定多了出血區的大小。Rosenberg等［11］用微量注射泵在9min內向大鼠尾狀核注入2μl含0.01～1.00U膠原酶(Ⅶ型)生理鹽水，注入膠原酶10min后即可觀察到血液滲出，在0.5U膠原酶組出血點周圍水腫明顯，且動物死亡率低，此方法比較適合ICH的長期實驗研究。優點是其出血是彌漫性的廣泛出血，血腫大小基本一致，該模型多具有典型的神經功能障礙，且運動功能的缺失長期存在。近年來，膠原酶誘導大鼠ICH模型在中醫藥研究中的應用主要集中在以下幾個方面:觀察腦含水量和病理生理學變化;中藥保護神經元的作用機制;抑制血腫紅細胞產物對腦細胞的損傷;促進神經再生，抑制炎癥反應。因此該模型適用于觀察神經功能缺失，血腫大小的改變及其與血腫消除機制有關的中醫藥實驗研究。缺點是出血方式為無明顯占位效應，滲血和血腫形成時間長，與臨床ICH急性發病情況不同，不適合血腫相關的血液循環障礙研究。自體血注入和膠原酶注入大鼠腦尾狀核建立ICH模型是目前中醫藥研究中使用最多的2種ICH模型。鄧世山等［12］通過制備自體血注入模型觀察桅子提取物(環烯醚萜總甙)對大鼠ICH病灶的局部作用，表明該藥通過減輕病灶血腫大小、降低小膠質細胞的浸潤及局部炎癥反應等改善出血引起的損傷作用。夏榮蓉等［13］同樣采用自體血注入模型觀察鎮肝熄風湯對大鼠低氧誘導子-1α(HIF-1α)的影響，結果鎮肝熄風湯組可提高腦組織HIF-1α陽性表達，拮抗腦細胞缺氧，從而減輕ICH急性損傷。魏微和張微微［14］利用膠原酶模型觀察β-七葉皂普鈉對大鼠ICH后腦含水量及腦組織超微結構變化，揭示藥物對神經元及內皮細胞腫脹的拮抗作用。陳旭等［15］則指出β-七葉皂普鈉抗腦水腫的作用可能與腦內精氨酸加壓素參與有關。何澤云等［16］觀察參麥注射液對大鼠ICH后遲發性神經細胞損傷的保護作用，發現該藥可減少ICH后海馬CA1區錐體細胞凋亡數目，抑制血腫周圍腦組織線粒體DN段的缺失。梁清華等［17］采用膠原酶法模型觀察鎮肝熄風湯可維持大鼠海馬細胞色素氧化酶(CCO)活性與錐體細胞的密度，減少丟失。肖嵐等［18］利用膠原酶模型探討腦溢安(丹皮、生地和地龍等)對ICH的保護作用，結果顯示腦溢安通過抑制P38MAKP信號轉導通路的激活，阻止細胞凋亡的發生從而發揮抗ICH作用。
2.3自發性腦出血模型
分原發與繼發2種，原發為自發性高血壓大鼠(spontaneoushypertensivecerebralhemorrhageinrat，SHCHR)，這種模型ICH率高，能重現人類自發性ICH發病過程，因存在遺傳局限性，存續困難，價格較高。繼發模型為腎血管性高血壓大鼠(renovascularhypertensiverats，RHR)，這種模型易于建立，無遺傳缺陷，且有與人類ICH相似的高血壓動脈硬化病理生理學基礎。但其自發性ICH的發生率較低，并且出血量及出血區域不易控制。Wu等［19］試圖通過將改變遺傳基因的方式和自體血注入法結合的方法改進模型，制備與人類ICH更為相似的病理變化模型，但研究發現這種結合并不能使血腫和周圍水腫帶擴大。Wakisaka等［20］試圖用藥物制備ICH模型，給C57BL/6小鼠輸注人AngII和一氧化氮合酶抑制劑誘導產生慢性高血壓，再通過注射AngII進而產生急性高血壓，從而發生高血壓ICH，也并未明顯提高發病率。此外研究人員也在積極探索基因工程實驗動物模型，如基因敲除小鼠對ICH發病機制方面的研究更具優勢。由于自發性ICH動物模型在ICH的部位和出血量方面都還不易控制，治療的標準和規范的測量方法也需要同步跟進，都限制了模型的廣泛使用。但由于其更接近自然ICH發生發展過程，如能克服上述缺點，自發性ICH模型應該是最理想的ICH模型。
2.4微球囊充脹法
主要用來模擬ICH的占位效應。Sinar等［21］將微球囊插入SD大鼠頭部右側尾狀核，通過調節球囊內液體量模擬不同血腫大小，用于研究ICH血腫的占位效應和血腫后神經行為學的改變。LopezValde等［22］在Sinar等［21］基礎上采用微球囊充氣和放氣的方法模擬血腫形成和清除的過程，研究外科血腫清除術的最佳治療時機及臨床療效。由于只能模擬ICH后占位病變引起的的各種病理生理改變，對炎癥等引起的血管活性物質釋放、缺氧及氧化應激等沒有考慮，不適合中藥作用機理的研究，因此在中醫藥研究中已較很少使用該方法了。
3ICH動物模型在中醫藥研究中急需解決的問題
中醫學認為ICH的病理病機是臟腑功能失調，氣血逆亂，導致腦脈受損，血溢脈外。而離經之血形成癖血，癖血不去、阻礙新血生化之機。近年來學者對中醫藥治療ICH作了大量研究，研究范圍涉及治則、治法、證候及療效評價體系等［23-25］?！安∽C結合”是目前中醫臨床診療的特點，也是中藥新藥研究的要求，更是中西醫結合的切入點;但是在中醫藥動物模型的建立上，病證結合模型的建立卻很難。借用西醫學“病”的模型，很難體現中醫辨證論治的特色;單純從中醫“證”的角度入手，同屬一證的不同病的多種病理變化，同一動物模型難以全面體現。因此研制病證結合模型是研究中醫藥ICH作用機制比較可行的方法，建立以病統證、病證合參的動物模型是實用而可取的。近年來也有研究人員在不斷的嘗試從病證結合角度探索大鼠ICH動物模型的研制，如用腦內注射膠原酶配合大鼠自體糞便灌胃的方法復制中風病痰熱腑實證大鼠模型，并用通過對通腑醒神膠囊對中風病痰熱腑實證大鼠的治療作用改善模型大鼠神經缺損體征和痰熱腑實證癥狀及降低腦組織含水量，從而反證了該病證結合模型的可行性［26］。也有人用中藥灌腸的辦法治療ICH后水腫［27-28］。但是目前有關病證結合ICH模型方面的文獻報道很少。但中醫藥在ICH治療中的作用還是不容忽視的，實驗表明中醫、針灸能有效改善ICH后半暗帶血流，抑制半暗帶區的神經細胞凋亡，促進神經功能恢復。實驗表明補陽還五湯能夠有效抑制大鼠ICH后AQP4蛋白的表達，減輕腦水腫，對ICH后腦組織發揮保護作用［29］。劉海洋等［30］研究表明丹參注射液對大鼠ICH灶周圍神經元的凋亡具有較好的抑制作用;同時黃芪聯合丹參注射液對大鼠ICH半暗帶區神經元凋亡也具有較好的抑制作用。
4展望
綜上所述，對于探索適合中醫藥研究的ICH動物模型，即病證結合模型，為ICH動物模型在中醫藥研究提供了一條很好的思路，即在現代醫學動物模型所造成的“病”的基礎上，從本病多種致病因素之間相互轉化的角度入手，建立“證”的模型，并從血腫的大小、神經體征的缺失評分及中醫所特有的舌象、脈象等角度進行評價，進而設計一種符合中醫臨床的ICH動物模型。不斷改進動物造模方法使其更接近臨床病理生理過程，還要解決如何使其造模方法標準化的問題，才能獲得更廣泛的認可，才能有效解決ICH從實驗研究到臨床應用的轉化，才是未來研究的關鍵。
作者：劉智 袁楠 蘭天野 宋伍 姜爽 郭焱 王健 單位：長春中醫藥大學 長春中醫藥大學附屬醫院
