中醫(yī)藥研究的應(yīng)用
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從生理功能來說，犬的生理功能與人類高度相似，犬ICH模型與人的ICH情況非常接近。從解剖結(jié)構(gòu)來說，豬腦的解剖結(jié)構(gòu)與人很相似、尤其是腦容積大、腦實(shí)質(zhì)呈回狀、腦白質(zhì)發(fā)達(dá)、模擬ICH情況更好，也比較理想。最近，一項關(guān)于高原ICH動物模型研究就以豬為對象，較好的模擬了高原ICH的情況［1］。從實(shí)驗效果來說，靈長類肯定是最理想的模型動物，可用于腦神經(jīng)保護(hù)劑因子等臨床前藥物的安全性和有效性評估。但因其價格昂貴，來源少，不可能大規(guī)模用于實(shí)驗室研究?？v觀目前的ICH實(shí)驗研究，ICH動物模型還是采用嚙齒類動物較多，且目前已積累了大量實(shí)驗研究基礎(chǔ)資料。比較常見的是家兔和大鼠。家兔因基底節(jié)區(qū)相對發(fā)達(dá)，定位相對容易，且耳緣靜脈取血方便和出血后神經(jīng)功能缺損明顯等特點(diǎn)，在研究ICH的實(shí)驗中也較常用。大鼠因價格低、體型小、容易管理和進(jìn)行實(shí)驗性手術(shù)，是目前使用最廣泛的ICH模型動物，大鼠腦尾殼核屬基底節(jié)，是腦內(nèi)最大核團(tuán)，易于進(jìn)行腦立體定位，是人類高血壓ICH最好發(fā)部位，目前大鼠ICH模型研究多定位于鼠腦尾殼核。每種動物模型都有其優(yōu)缺點(diǎn)，但就目前查閱到有關(guān)中醫(yī)藥對ICH的治療作用的實(shí)驗研究95%都選擇了大鼠作為實(shí)驗用動物。
2中醫(yī)藥研究中常見的ICH模型的制備方法
目前中醫(yī)藥復(fù)方治療ICH的實(shí)驗研究很多，有關(guān)ICH動物模型的造模方法的文獻(xiàn)也很多，但歸納起來方法的選擇無外乎以下4種類型。腦內(nèi)注血法、細(xì)菌膠原酶注入法、自發(fā)性ICH動物模型和微球囊充脹法，其中前2種造模方法因操作相對容易，外部條件易控制，成為目前在中醫(yī)和中藥研究中使用最多的模型，第3種ICH模型因與臨床發(fā)病相似，也有不少研究采用，第4種模型目前應(yīng)用較少，但不管是那種類型，都無法完全模擬人的疾病狀態(tài)，而且造模過程手技要求都比較高，相對其他病種動物模型的制備較難掌握。
2.1腦內(nèi)注血法
將自體動脈血或凝血塊接注入腦內(nèi)直是最常用的ICH造模方法。該方法操作成功與否關(guān)鍵在于動脈血的采集與推注時間和注入速度的控制。方法初期是將血液通過穿刺針注入到模型鼠腦右側(cè)尾狀核，由于當(dāng)時沒有考慮到血液本身對模型的影響和注射壓力變化等因素，模型的成功率較低。后來Yu等［2］采用了一種自制的雙套管進(jìn)行2次注血、3次拔針的改良法制備出了一種兔腦基底神經(jīng)節(jié)出血模型。這種方法操作過于繁瑣，但避免了血液沿針道反流的問題，目前國內(nèi)許多中藥復(fù)方的藥理研究均采用在此方法基礎(chǔ)上改良的大鼠尾殼核雙套管注血法。不同的實(shí)驗室根據(jù)習(xí)慣采用的自體血的采血部位各不相同。Nath等［3］介紹了從大鼠一側(cè)股動脈插管抽取新鮮未肝素化自體動脈血。李慧等［4］用微量注射器在一側(cè)股動脈抽取50μl動脈血，注血后留針20min，以避免血液自針道反流。郭松韜和吳喜［5］從大鼠心室腔內(nèi)抽取血液。劉勝達(dá)等［6］以大鼠尾末端血代替股動脈取血，在2.5min內(nèi)完成注入，留針5min。從查閱的文獻(xiàn)看取血部位除了上述部位還有內(nèi)眥取血和舌下靜脈取血等。每種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，如內(nèi)眥取血量較準(zhǔn)確，但成功率低;斷尾取血易造成混動靜脈血混血，同時采血量不易控制;心臟穿刺取血具有時間短、不凝血和簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，但技術(shù)要求高，穿刺定位須準(zhǔn)確且不能反復(fù)穿刺。注血方式也在不斷改進(jìn)，呂田明等［7］向尾殼核內(nèi)2次注射不凝固自體動脈血。夏鷹等［8］采用大鼠尾動脈插管抽取新鮮自體動脈血分3次注入尾殼核。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:出血量可人為控制，觀察血液凝固過程中局部腦組織的循環(huán)異常及血管活性物質(zhì)釋放物的病理生理學(xué)作用［9］。該法形成的血腫形態(tài)與出血量沒有直接關(guān)系，若注血速度過快，血液容易沿針道反流，因注射帶來的壓力過大易脹裂腦組織使血液流入腦室，造成血腫形態(tài)和大小的重復(fù)性較差。為了避免血液沿針道反流，呂田明和陸兵勛［10］提出采用凝固血進(jìn)行造模。實(shí)驗使用靜脈留置針取血并待其凝固后，使用腦立體定位儀凝固的血液注入尾狀核中。該模型血腫規(guī)則，占位情況明顯，在血腫周圍有水腫及血液循環(huán)障礙等形成。但造模過程中發(fā)現(xiàn)由于血液凝固后容易析出血清，血清會沿針道反流，給操作帶來麻煩，所以在操作上要求快速注入(速度為20μl/min)。本實(shí)驗室一直從事抗ICH中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究，結(jié)合文獻(xiàn)方法，通過反復(fù)實(shí)踐，采用鼠尾動脈取血，使用留置針分2次進(jìn)行尾殼核注入的方法進(jìn)行實(shí)驗研究，結(jié)果表明模型動物的死亡率相對較低，成模率和重復(fù)性均較好。并且與ICH臨床的發(fā)病過程類似性高，對藥物作用的機(jī)制研究較合適。
2.2注入膠原酶法
膠原酶是一種能特異降解間質(zhì)和基底膜膠原的蛋白分解酶。當(dāng)腦內(nèi)注入膠原酶20min后，腦血管基底膜上的膠原蛋白即被破壞，進(jìn)一步損傷血腦屏障，引起血管滲血，約4h出血區(qū)融合成片，膠原酶注入量的決定多了出血區(qū)的大小。Rosenberg等［11］用微量注射泵在9min內(nèi)向大鼠尾狀核注入2μl含0.01～1.00U膠原酶(Ⅶ型)生理鹽水，注入膠原酶10min后即可觀察到血液滲出，在0.5U膠原酶組出血點(diǎn)周圍水腫明顯，且動物死亡率低，此方法比較適合ICH的長期實(shí)驗研究。優(yōu)點(diǎn)是其出血是彌漫性的廣泛出血，血腫大小基本一致，該模型多具有典型的神經(jīng)功能障礙，且運(yùn)動功能的缺失長期存在。近年來，膠原酶誘導(dǎo)大鼠ICH模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用主要集中在以下幾個方面:觀察腦含水量和病理生理學(xué)變化;中藥保護(hù)神經(jīng)元的作用機(jī)制;抑制血腫紅細(xì)胞產(chǎn)物對腦細(xì)胞的損傷;促進(jìn)神經(jīng)再生，抑制炎癥反應(yīng)。因此該模型適用于觀察神經(jīng)功能缺失，血腫大小的改變及其與血腫消除機(jī)制有關(guān)的中醫(yī)藥實(shí)驗研究。缺點(diǎn)是出血方式為無明顯占位效應(yīng)，滲血和血腫形成時間長，與臨床ICH急性發(fā)病情況不同，不適合血腫相關(guān)的血液循環(huán)障礙研究。自體血注入和膠原酶注入大鼠腦尾狀核建立ICH模型是目前中醫(yī)藥研究中使用最多的2種ICH模型。鄧世山等［12］通過制備自體血注入模型觀察桅子提取物(環(huán)烯醚萜總甙)對大鼠ICH病灶的局部作用，表明該藥通過減輕病灶血腫大小、降低小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤及局部炎癥反應(yīng)等改善出血引起的損傷作用。夏榮蓉等［13］同樣采用自體血注入模型觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對大鼠低氧誘導(dǎo)子-1α(HIF-1α)的影響，結(jié)果鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組可提高腦組織HIF-1α陽性表達(dá)，拮抗腦細(xì)胞缺氧，從而減輕ICH急性損傷。魏微和張微微［14］利用膠原酶模型觀察β-七葉皂普鈉對大鼠ICH后腦含水量及腦組織超微結(jié)構(gòu)變化，揭示藥物對神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞腫脹的拮抗作用。陳旭等［15］則指出β-七葉皂普鈉抗腦水腫的作用可能與腦內(nèi)精氨酸加壓素參與有關(guān)。何澤云等［16］觀察參麥注射液對大鼠ICH后遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)該藥可減少ICH后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)目，抑制血腫周圍腦組織線粒體DN段的缺失。梁清華等［17］采用膠原酶法模型觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可維持大鼠海馬細(xì)胞色素氧化酶(CCO)活性與錐體細(xì)胞的密度，減少丟失。肖嵐等［18］利用膠原酶模型探討腦溢安(丹皮、生地和地龍等)對ICH的保護(hù)作用，結(jié)果顯示腦溢安通過抑制P38MAKP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生從而發(fā)揮抗ICH作用。
2.3自發(fā)性腦出血模型
分原發(fā)與繼發(fā)2種，原發(fā)為自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneoushypertensivecerebralhemorrhageinrat，SHCHR)，這種模型ICH率高，能重現(xiàn)人類自發(fā)性ICH發(fā)病過程，因存在遺傳局限性，存續(xù)困難，價格較高。繼發(fā)模型為腎血管性高血壓大鼠(renovascularhypertensiverats，RHR)，這種模型易于建立，無遺傳缺陷，且有與人類ICH相似的高血壓動脈硬化病理生理學(xué)基礎(chǔ)。但其自發(fā)性ICH的發(fā)生率較低，并且出血量及出血區(qū)域不易控制。Wu等［19］試圖通過將改變遺傳基因的方式和自體血注入法結(jié)合的方法改進(jìn)模型，制備與人類ICH更為相似的病理變化模型，但研究發(fā)現(xiàn)這種結(jié)合并不能使血腫和周圍水腫帶擴(kuò)大。Wakisaka等［20］試圖用藥物制備ICH模型，給C57BL/6小鼠輸注人AngII和一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性高血壓，再通過注射AngII進(jìn)而產(chǎn)生急性高血壓，從而發(fā)生高血壓ICH，也并未明顯提高發(fā)病率。此外研究人員也在積極探索基因工程實(shí)驗動物模型，如基因敲除小鼠對ICH發(fā)病機(jī)制方面的研究更具優(yōu)勢。由于自發(fā)性ICH動物模型在ICH的部位和出血量方面都還不易控制，治療的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的測量方法也需要同步跟進(jìn)，都限制了模型的廣泛使用。但由于其更接近自然ICH發(fā)生發(fā)展過程，如能克服上述缺點(diǎn)，自發(fā)性ICH模型應(yīng)該是最理想的ICH模型。
2.4微球囊充脹法
主要用來模擬ICH的占位效應(yīng)。Sinar等［21］將微球囊插入SD大鼠頭部右側(cè)尾狀核，通過調(diào)節(jié)球囊內(nèi)液體量模擬不同血腫大小，用于研究ICH血腫的占位效應(yīng)和血腫后神經(jīng)行為學(xué)的改變。LopezValde等［22］在Sinar等［21］基礎(chǔ)上采用微球囊充氣和放氣的方法模擬血腫形成和清除的過程，研究外科血腫清除術(shù)的最佳治療時機(jī)及臨床療效。由于只能模擬ICH后占位病變引起的的各種病理生理改變，對炎癥等引起的血管活性物質(zhì)釋放、缺氧及氧化應(yīng)激等沒有考慮，不適合中藥作用機(jī)理的研究，因此在中醫(yī)藥研究中已較很少使用該方法了。
3ICH動物模型在中醫(yī)藥研究中急需解決的問題
中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ICH的病理病機(jī)是臟腑功能失調(diào)，氣血逆亂，導(dǎo)致腦脈受損，血溢脈外。而離經(jīng)之血形成癖血，癖血不去、阻礙新血生化之機(jī)。近年來學(xué)者對中醫(yī)藥治療ICH作了大量研究，研究范圍涉及治則、治法、證候及療效評價體系等［23-25］?！安∽C結(jié)合”是目前中醫(yī)臨床診療的特點(diǎn)，也是中藥新藥研究的要求，更是中西醫(yī)結(jié)合的切入點(diǎn);但是在中醫(yī)藥動物模型的建立上，病證結(jié)合模型的建立卻很難。借用西醫(yī)學(xué)“病”的模型，很難體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治的特色;單純從中醫(yī)“證”的角度入手，同屬一證的不同病的多種病理變化，同一動物模型難以全面體現(xiàn)。因此研制病證結(jié)合模型是研究中醫(yī)藥ICH作用機(jī)制比較可行的方法，建立以病統(tǒng)證、病證合參的動物模型是實(shí)用而可取的。近年來也有研究人員在不斷的嘗試從病證結(jié)合角度探索大鼠ICH動物模型的研制，如用腦內(nèi)注射膠原酶配合大鼠自體糞便灌胃的方法復(fù)制中風(fēng)病痰熱腑實(shí)證大鼠模型，并用通過對通腑醒神膠囊對中風(fēng)病痰熱腑實(shí)證大鼠的治療作用改善模型大鼠神經(jīng)缺損體征和痰熱腑實(shí)證癥狀及降低腦組織含水量，從而反證了該病證結(jié)合模型的可行性［26］。也有人用中藥灌腸的辦法治療ICH后水腫［27-28］。但是目前有關(guān)病證結(jié)合ICH模型方面的文獻(xiàn)報道很少。但中醫(yī)藥在ICH治療中的作用還是不容忽視的，實(shí)驗表明中醫(yī)、針灸能有效改善ICH后半暗帶血流，抑制半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。實(shí)驗表明補(bǔ)陽還五湯能夠有效抑制大鼠ICH后AQP4蛋白的表達(dá)，減輕腦水腫，對ICH后腦組織發(fā)揮保護(hù)作用［29］。劉海洋等［30］研究表明丹參注射液對大鼠ICH灶周圍神經(jīng)元的凋亡具有較好的抑制作用;同時黃芪聯(lián)合丹參注射液對大鼠ICH半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡也具有較好的抑制作用。
4展望
綜上所述，對于探索適合中醫(yī)藥研究的ICH動物模型，即病證結(jié)合模型，為ICH動物模型在中醫(yī)藥研究提供了一條很好的思路，即在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)動物模型所造成的“病”的基礎(chǔ)上，從本病多種致病因素之間相互轉(zhuǎn)化的角度入手，建立“證”的模型，并從血腫的大小、神經(jīng)體征的缺失評分及中醫(yī)所特有的舌象、脈象等角度進(jìn)行評價，進(jìn)而設(shè)計一種符合中醫(yī)臨床的ICH動物模型。不斷改進(jìn)動物造模方法使其更接近臨床病理生理過程，還要解決如何使其造模方法標(biāo)準(zhǔn)化的問題，才能獲得更廣泛的認(rèn)可，才能有效解決ICH從實(shí)驗研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，才是未來研究的關(guān)鍵。
作者：劉智 袁楠 蘭天野 宋伍 姜爽 郭焱 王健 單位：長春中醫(yī)藥大學(xué) 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院
