茶葉沖泡時茶多酚的溶出條件分析

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材料與方法

1材料與設備

綠茶(江蘇洞庭碧螺春)購于市場，2011年3月產;無水碳酸鈉、沒食子酸均為分析純;福林酚試劑天津博美科生物技術有限公司;表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、兒茶素(C)、咖啡堿(caffeine)標準品上海順勃生物工程有限公司。UV－2102PCS型紫外可見分光光度計上海尤尼柯儀器有限公司;LC－20A型高效液相色譜系統日本島津公司。

2試樣沖泡與茶多酚的測定方法

模擬生活泡茶，以綠茶為樣品，在不同的溫度、液料比、時間、次數、沖泡容器、是否加蓋和攪拌條件下進行實驗，分析不同因素對茶湯中茶多酚溶出量的影響，采用GB/T8313－2008［10］福林酚法對茶湯中多酚的溶出量進行計算。稱取1.0g的綠茶，分別加入100mL60、70、80、90、100℃的蒸餾水，沖泡5min，不攪拌，沖泡一次，過濾，用少許蒸餾水清洗濾渣，合并濾液，定容至100mL，測定茶湯中茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，分別以液料比為50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1(mL/g)加入80℃蒸餾水沖泡5min，測定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，加入150mL80℃的蒸餾水分別沖泡2、5、8、11、14min，測定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，加入150mL80℃的蒸餾水沖泡5min，過濾后的濾渣繼續進行第二次、第三次沖泡，測定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶分別置于同內徑的保溫杯和玻璃杯中，加入150mL80℃的蒸餾水沖泡5min，另采用保溫杯進行加蓋與無蓋處理以及在無蓋條件下進行攪拌和不攪拌處理的實驗，測定茶多酚溶出量。

3響應面分析實驗優化茶多酚提取工藝

采用DesignExpert7.0，根據Box－Behnken設計原理，在單因素實驗的基礎上，選取溫度、液料比和時間三個因素，以茶多酚溶出量為響應值，采用三因素三水平響應面分析方法對茶多酚提取工藝進行優化，響應面實驗因素與水平見表1。

4兒茶素類及咖啡堿的測定方法

采用ZorbaxSB－C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動相A:3%甲酸水溶液，流動相B:甲醇。梯度洗脫程序為(min/B%):0/2、20/32、30/40。檢測波長278nm，流速1.0mL/min，柱溫35℃，進樣量20μL。分別精密稱取8種標準品10mg置于10mL的容量瓶中，定容即得濃度為1mg/mL的標準儲備溶液，分別吸取一定量的上述標準儲備液配成系列標準溶液，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。為方便與樣品圖進行分析，配制濃度分別為咖啡堿100μg/mL、EGCG50μg/mL、EGC200μg/mL、ECG100μg/mL、GCG100μg/mL、EC100μg/mL、C50μg/mL和GC200μg/mL的混合標準溶液，按1.4.1條件進樣得到混合標準品液相圖。以響應面分析實驗得到的綠茶茶多酚最適沖泡條件進行沖泡，茶湯過0.22μm水相濾膜，進樣測定峰面積，根據各成分標準曲線得出濃度并算出溶出量。

5數據統計

實驗結果以平均值±標準差(珚X±SD)表示，每個處理重復3次，顯著性分析采用SPSS17.0分析軟件進行。

結果與分析

1單因素實驗

由圖1可知，60～80℃茶多酚溶出量隨著溫度的升高而增加明顯，隨后增加變緩，80～100℃間差異不顯著(p＞0.05)。因綠茶采用嫩葉加工制成，水溫過低，溶出量較少，水溫過高，湯色易變黃，茶葉表面易熟化、結膜，阻礙茶多酚等成分的溶出，且維生素C等有益成分易遭破壞，綜合考慮，選取80℃為最適溫度。由圖2可知，50～150mL/g時隨著液料比的增加，茶多酚溶出量增大，150∶1(mL/g)時達113.87mg/g，隨后呈輕微下降趨勢，在相同的溫度和時間里，水量越大，降溫速度越慢，茶多酚會部分發生氧化，并且伴隨茶湯中溶出物含量增多，溶劑比例增加，對溶出物起到一定的稀釋作用，影響口感，故選擇150∶1(mL/g)為最適液料比。由圖3可知，綠茶的茶多酚溶出量隨著時間的增加，呈現先增后減的趨勢，且在5min達到最大值，一般茶的滋味隨著沖泡時間延長而逐漸增濃，茶多酚溶出量逐漸增大，但時間過長，會造成部分茶多酚氧化，選擇5min為最適時間。不同沖泡次數對茶多酚溶出量的影響見圖4。第一次沖泡可使大部分茶多酚溶出，第二次后溶出量明顯減少，而隨著次數的增加，較易溶出的氨基酸、維生素C和可溶性糖等成分的溶出量減少，口感明顯變差，因此確定沖泡次數為1次。采用綠茶對生活習慣因素(沖泡容器、是否加蓋、是否攪拌)沖泡下茶多酚的溶出量進行研究，其中沖泡容器選擇玻璃杯和保溫杯，結果見表2。保溫杯起到恒溫作用，多酚較易溶出，可見泡茶所用器具對茶多酚的溶出量存在一定的影響，但是作用不大，影響不顯著(p＞0.05)。攪拌可使茶葉充分浸泡，多酚的溶出量大幅度提高，但伴隨著其他成分的大幅度溶出，會一定程度的影響口感，可根據個人喜好決定攪拌時間。對于綠茶，不加蓋溶出量略高，可根據實際情況而定。

2響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，根據響應面實驗設計，以溫度、液料比、時間3個因素為自變量，茶多酚溶出量為響應值，實驗結果見表3。經二次多項回歸擬合，得到各實驗因子對響應面影響的回歸方程為:茶多酚溶出量(mg/g)=116.35+8.05A+1.26B+12.72C－2.72AB－3.55AC－0.33BC－19.60A2－8.58B2－9.02C2。對模型方程進行方差分析表明，該方程顯著，結果見表4。其中校正決定系數R2Adj=0.9622，相關系數R2=0.9834，說明回歸方程對實驗擬合度較好，失擬項不顯著，各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，使響應值變化復雜，所以二次相應曲面回歸方程能夠很好的擬合本實驗所得的結果。響應面圖形是響應值對各因素(A、B、C)所構成三維空間的曲面圖，根據回歸方程作出不同因子的響應面分析圖，結果見圖5。響應面圖代表著在第三個變量保持最佳水平時，另兩個獨立變量之間的交互作用。由響應面實驗得綠茶茶多酚最適沖泡條件為:溫度81.42℃、液料比151.92∶1(mL/g)、時間7.03min，茶多酚溶出量理論最大值為121.23mg/g，為了實際操作方便，修正條件為溫度81℃、液料比150∶1(mL/g)、時間7min，采用修改后最適條件進行驗證實驗，結果為茶多酚溶出量為(112.80±0.10)mg/g，相對標準偏差RSD為0.88%。

3高效液相色譜分析結果

在以茶多酚為響應值得出的最適條件下進行沖泡，采用高效液相色譜法，以總酚研究為基礎，對茶湯中兒茶素類及咖啡堿溶出量進行分析，進一步探討最適沖泡條件下各成分溶出量之間相互作用對茶滋味的影響。各成分標準曲線和線性范圍見表5，其中保留時間與混合標準品色譜圖相對應。混合標準品色譜圖(A)及綠茶最適沖泡條件下樣品色譜圖(B)見圖6。由圖6可知，樣品與標準品圖中所對應峰的信息一致，雖綠茶成分復雜，但所研究成分在30min內均得到分離，可以進行HPLC定量分析。根據標準曲線回歸方程與峰面積可計算出各成分的溶出量，結果見表6。在響應面最適條件下沖泡，總兒茶素溶出量占茶多酚溶出量的57.29%，是多酚類物質的主體部分，賦予了綠茶特有的澀味。其中EGCG、ECG、EGC和EC的溶出量較高，GCG未檢出，C和GC的溶出量較少。除總酚外，咖啡堿溶出量也較高，使綠茶略帶苦味，因綠茶屬不發酵茶，咖啡堿的含量相比較其他發酵茶略低些，但最適條件沖泡仍得到較高的溶出量，與兒茶素類共同作用，對改善茶湯的滋味起到一定的作用，減輕單一存在的苦味和澀味，使茶味醇和。

結論

本實驗模擬生活泡茶，以綠茶為樣品，研究了溫度、液料比、時間、次數以及生活習慣因素對茶多酚溶出量的影響。通過單因素實驗和響應面分析實驗得出綠茶茶多酚的最適沖泡溶出條件:1g綠茶加150mL水在81℃下沖泡7min，茶多酚溶出量為112.80mg/g。生活中小小的變化可以使溶出量大幅度提高，為避免口感過于單薄或濃重，在可接受范圍內可適當攪拌，不同的容器和是否加蓋可根據個人生活習慣以及口感需求進行調整。在最適條件下沖泡，采用液相對兒茶素類和咖啡堿進行測定，發現EGCG、ECG、EGC、EC和咖啡堿有較高的溶出量，對改善綠茶的滋味起著重要的作用。（本文作者：陳正函、呂曉玲、徐蕾然、孟穎、張鋒 單位：天津科技大學、葫蘆島茂華生物有限責任公司）