茶葉沖泡時(shí)茶多酚的溶出條件分析

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材料與方法

1材料與設(shè)備

綠茶(江蘇洞庭碧螺春)購(gòu)于市場(chǎng)，2011年3月產(chǎn);無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸均為分析純;福林酚試劑天津博美科生物技術(shù)有限公司;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、表兒茶素(EC)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、兒茶素(C)、咖啡堿(caffeine)標(biāo)準(zhǔn)品上海順勃生物工程有限公司。UV－2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海尤尼柯儀器有限公司;LC－20A型高效液相色譜系統(tǒng)日本島津公司。

2試樣沖泡與茶多酚的測(cè)定方法

模擬生活泡茶，以綠茶為樣品，在不同的溫度、液料比、時(shí)間、次數(shù)、沖泡容器、是否加蓋和攪拌條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析不同因素對(duì)茶湯中茶多酚溶出量的影響，采用GB/T8313－2008［10］福林酚法對(duì)茶湯中多酚的溶出量進(jìn)行計(jì)算。稱取1.0g的綠茶，分別加入100mL60、70、80、90、100℃的蒸餾水，沖泡5min，不攪拌，沖泡一次，過(guò)濾，用少許蒸餾水清洗濾渣，合并濾液，定容至100mL，測(cè)定茶湯中茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，分別以液料比為50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1(mL/g)加入80℃蒸餾水沖泡5min，測(cè)定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，加入150mL80℃的蒸餾水分別沖泡2、5、8、11、14min，測(cè)定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶，加入150mL80℃的蒸餾水沖泡5min，過(guò)濾后的濾渣繼續(xù)進(jìn)行第二次、第三次沖泡，測(cè)定茶多酚溶出量。稱取1.0g綠茶分別置于同內(nèi)徑的保溫杯和玻璃杯中，加入150mL80℃的蒸餾水沖泡5min，另采用保溫杯進(jìn)行加蓋與無(wú)蓋處理以及在無(wú)蓋條件下進(jìn)行攪拌和不攪拌處理的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定茶多酚溶出量。

3響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茶多酚提取工藝

采用DesignExpert7.0，根據(jù)Box－Behnken設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溫度、液料比和時(shí)間三個(gè)因素，以茶多酚溶出量為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法對(duì)茶多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

4兒茶素類及咖啡堿的測(cè)定方法

采用ZorbaxSB－C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相A:3%甲酸水溶液，流動(dòng)相B:甲醇。梯度洗脫程序?yàn)?min/B%):0/2、20/32、30/40。檢測(cè)波長(zhǎng)278nm，流速1.0mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL。分別精密稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品10mg置于10mL的容量瓶中，定容即得濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別吸取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為方便與樣品圖進(jìn)行分析，配制濃度分別為咖啡堿100μg/mL、EGCG50μg/mL、EGC200μg/mL、ECG100μg/mL、GCG100μg/mL、EC100μg/mL、C50μg/mL和GC200μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.1條件進(jìn)樣得到混合標(biāo)準(zhǔn)品液相圖。以響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得到的綠茶茶多酚最適沖泡條件進(jìn)行沖泡，茶湯過(guò)0.22μm水相濾膜，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，根據(jù)各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線得出濃度并算出溶出量。

5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(珚X±SD)表示，每個(gè)處理重復(fù)3次，顯著性分析采用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行。

結(jié)果與分析

1單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，60～80℃茶多酚溶出量隨著溫度的升高而增加明顯，隨后增加變緩，80～100℃間差異不顯著(p＞0.05)。因綠茶采用嫩葉加工制成，水溫過(guò)低，溶出量較少，水溫過(guò)高，湯色易變黃，茶葉表面易熟化、結(jié)膜，阻礙茶多酚等成分的溶出，且維生素C等有益成分易遭破壞，綜合考慮，選取80℃為最適溫度。由圖2可知，50～150mL/g時(shí)隨著液料比的增加，茶多酚溶出量增大，150∶1(mL/g)時(shí)達(dá)113.87mg/g，隨后呈輕微下降趨勢(shì)，在相同的溫度和時(shí)間里，水量越大，降溫速度越慢，茶多酚會(huì)部分發(fā)生氧化，并且伴隨茶湯中溶出物含量增多，溶劑比例增加，對(duì)溶出物起到一定的稀釋作用，影響口感，故選擇150∶1(mL/g)為最適液料比。由圖3可知，綠茶的茶多酚溶出量隨著時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且在5min達(dá)到最大值，一般茶的滋味隨著沖泡時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增濃，茶多酚溶出量逐漸增大，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成部分茶多酚氧化，選擇5min為最適時(shí)間。不同沖泡次數(shù)對(duì)茶多酚溶出量的影響見(jiàn)圖4。第一次沖泡可使大部分茶多酚溶出，第二次后溶出量明顯減少，而隨著次數(shù)的增加，較易溶出的氨基酸、維生素C和可溶性糖等成分的溶出量減少，口感明顯變差，因此確定沖泡次數(shù)為1次。采用綠茶對(duì)生活習(xí)慣因素(沖泡容器、是否加蓋、是否攪拌)沖泡下茶多酚的溶出量進(jìn)行研究，其中沖泡容器選擇玻璃杯和保溫杯，結(jié)果見(jiàn)表2。保溫杯起到恒溫作用，多酚較易溶出，可見(jiàn)泡茶所用器具對(duì)茶多酚的溶出量存在一定的影響，但是作用不大，影響不顯著(p＞0.05)。攪拌可使茶葉充分浸泡，多酚的溶出量大幅度提高，但伴隨著其他成分的大幅度溶出，會(huì)一定程度的影響口感，可根據(jù)個(gè)人喜好決定攪拌時(shí)間。對(duì)于綠茶，不加蓋溶出量略高，可根據(jù)實(shí)際情況而定。

2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以溫度、液料比、時(shí)間3個(gè)因素為自變量，茶多酚溶出量為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合，得到各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)面影響的回歸方程為:茶多酚溶出量(mg/g)=116.35+8.05A+1.26B+12.72C－2.72AB－3.55AC－0.33BC－19.60A2－8.58B2－9.02C2。對(duì)模型方程進(jìn)行方差分析表明，該方程顯著，結(jié)果見(jiàn)表4。其中校正決定系數(shù)R2Adj=0.9622，相關(guān)系數(shù)R2=0.9834，說(shuō)明回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度較好，失擬項(xiàng)不顯著，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，使響應(yīng)值變化復(fù)雜，所以二次相應(yīng)曲面回歸方程能夠很好的擬合本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素(A、B、C)所構(gòu)成三維空間的曲面圖，根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。響應(yīng)面圖代表著在第三個(gè)變量保持最佳水平時(shí)，另兩個(gè)獨(dú)立變量之間的交互作用。由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得綠茶茶多酚最適沖泡條件為:溫度81.42℃、液料比151.92∶1(mL/g)、時(shí)間7.03min，茶多酚溶出量理論最大值為121.23mg/g，為了實(shí)際操作方便，修正條件為溫度81℃、液料比150∶1(mL/g)、時(shí)間7min，采用修改后最適條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為茶多酚溶出量為(112.80±0.10)mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88%。

3高效液相色譜分析結(jié)果

在以茶多酚為響應(yīng)值得出的最適條件下進(jìn)行沖泡，采用高效液相色譜法，以總酚研究為基礎(chǔ)，對(duì)茶湯中兒茶素類及咖啡堿溶出量進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討最適沖泡條件下各成分溶出量之間相互作用對(duì)茶滋味的影響。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍見(jiàn)表5，其中保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖相對(duì)應(yīng)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品色譜圖(A)及綠茶最適沖泡條件下樣品色譜圖(B)見(jiàn)圖6。由圖6可知，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品圖中所對(duì)應(yīng)峰的信息一致，雖綠茶成分復(fù)雜，但所研究成分在30min內(nèi)均得到分離，可以進(jìn)行HPLC定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與峰面積可計(jì)算出各成分的溶出量，結(jié)果見(jiàn)表6。在響應(yīng)面最適條件下沖泡，總兒茶素溶出量占茶多酚溶出量的57.29%，是多酚類物質(zhì)的主體部分，賦予了綠茶特有的澀味。其中EGCG、ECG、EGC和EC的溶出量較高，GCG未檢出，C和GC的溶出量較少。除總酚外，咖啡堿溶出量也較高，使綠茶略帶苦味，因綠茶屬不發(fā)酵茶，咖啡堿的含量相比較其他發(fā)酵茶略低些，但最適條件沖泡仍得到較高的溶出量，與兒茶素類共同作用，對(duì)改善茶湯的滋味起到一定的作用，減輕單一存在的苦味和澀味，使茶味醇和。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M生活泡茶，以綠茶為樣品，研究了溫度、液料比、時(shí)間、次數(shù)以及生活習(xí)慣因素對(duì)茶多酚溶出量的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得出綠茶茶多酚的最適沖泡溶出條件:1g綠茶加150mL水在81℃下沖泡7min，茶多酚溶出量為112.80mg/g。生活中小小的變化可以使溶出量大幅度提高，為避免口感過(guò)于單薄或濃重，在可接受范圍內(nèi)可適當(dāng)攪拌，不同的容器和是否加蓋可根據(jù)個(gè)人生活習(xí)慣以及口感需求進(jìn)行調(diào)整。在最適條件下沖泡，采用液相對(duì)兒茶素類和咖啡堿進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)EGCG、ECG、EGC、EC和咖啡堿有較高的溶出量，對(duì)改善綠茶的滋味起著重要的作用。（本文作者：陳正函、呂曉玲、徐蕾然、孟穎、張鋒 單位：天津科技大學(xué)、葫蘆島茂華生物有限責(zé)任公司）