傳統(tǒng)工藝陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中變化分析
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摘要：該研究分析了山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝發(fā)酵過程中淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶酶活變化，并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、酒精度、總酸、有機(jī)酸和氨基酸等常規(guī)成分的變化規(guī)律與形成機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，酒精發(fā)酵階段，4種酶活力變化不大，醋酸發(fā)酵階段，4種酶活力均有所降低；發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉含量由64.05%降至18.88%；酒精發(fā)酵階段，總糖含量從11.88%降至1.12%，醋酸發(fā)酵階段，總糖含量從2.28%增至7.35%，熏蒸階段，總糖含量從7.13%降至5.89%；酒精含量在酒精發(fā)酵過程中從1.3%vol增至5.7%vol，到發(fā)酵22d時(shí)幾乎降為0；總酸含量在1～22d內(nèi)從1.17%增至10.23%；在發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸含量從1.03mg/g增至76.25mg/g；酒精發(fā)酵階段，乳酸含量從1.94mg/g增至60.60mg/g，隨后含量變化較小。
關(guān)鍵詞：山西老陳醋；傳統(tǒng)工藝；常規(guī)成分；分析
山西老陳醋是我國傳統(tǒng)的四大名醋之一，其獨(dú)特生產(chǎn)工藝的確立已有300多年的歷史，被列為國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，產(chǎn)品具有有機(jī)酸組成豐富、氨基酸含量高、品質(zhì)和風(fēng)味優(yōu)良等特點(diǎn)[1]。山西老陳醋的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，以高粱、麩皮為主要原料，以谷糠為輔料，以大麥、豌豆為原料制作的大曲作為糖化發(fā)酵劑，高粱、大曲、麩皮和谷糠的比例為100:62.5:70:100，生產(chǎn)工藝包括原料處理、拌曲、（糖化）酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、熏蒸（醋醅）、淋醋、陳釀等步驟[1]。整個(gè)生產(chǎn)過程，除淋醋和陳釀階段外，歷經(jīng)31d，其中1～16d為酒精發(fā)酵，17～25d為醋酸發(fā)酵，26～31d為熏蒸。其中熏蒸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)中一道特有的工序，在這一過程中醋醅由黃色變?yōu)樯詈稚茉黾哟椎纳珴珊徒瓜阄?，對傳統(tǒng)山西老陳醋色、香、味的形成具有重要的作用關(guān)于食醋生產(chǎn)過程中常規(guī)成分的變化分析已有很多報(bào)道[3-9]。但對山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中常規(guī)成分的變化研究報(bào)道很少。本研究分析了山西老陳醋在發(fā)酵及熏蒸過程中糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等酶活變化，并對發(fā)酵及熏蒸過程中淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、有機(jī)酸和氨基酸態(tài)氮等成分變化規(guī)律與形成機(jī)理進(jìn)行了分析。研究結(jié)果對山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的改良具有指導(dǎo)意義。
1材料與方法
1.1材料與試劑
實(shí)驗(yàn)樣品均取自山西老陳醋集團(tuán)有限公司傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)車間。在發(fā)酵的第1、3、5、8、11、14、16天（酒精發(fā)酵）采集酒醪樣品；第17天、19～25天（醋酸發(fā)酵）采集醋醅樣品；第27～31天（熏蒸階段）采集熏醅樣品。NaOH、甲醇、冰醋酸、CHCl3、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、乳酸、檸檬酸（均為優(yōu)級純）：美國Sigma公司；蒽酮（分析純）：上海試劑一廠。
1.2儀器與設(shè)備
Z-5000型原子吸收分光光度計(jì)：日本日立株式會社；AF-610B型原子熒光分光光度計(jì)：北京瑞麗儀器有限公司；L-8000型全自動氨基酸分析儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；Waters2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；HC-2062型高速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1淀粉酶、糖化酶和蛋白酶活力的測定
淀粉酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dini-trosalicylicacid，DNS）比色法[10]，以1g物料在40℃，pH5.6的條件下，每1min水解得到的還原糖的量為一個(gè)總淀粉酶活力單位（U/g）。糖化酶活力的測定參照GB8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》的方法進(jìn)行[11]，并略有改動，以1g物料在40℃，pH4.6的條件下，每1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖為一個(gè)糖化酶活力單位（U/g）。蛋白酶活力的測定參照國標(biāo)GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林比色法[12]，以1g物料在40℃，pH3.0或pH7.2，每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為一個(gè)酸性或中性蛋白酶活力單位（U/g）。
1.3.2理化指標(biāo)的測定
水分含量的測定參照GB5009.3—2010《食品中水分的測定》中的105℃恒質(zhì)量法[13]；淀粉含量的測定參照GB/T5514—2008《糧食、油料中淀粉含量測定》中酶水解法[14]；蛋白質(zhì)含量的測定參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的自動凱氏定氮儀法[15]；脂肪含量的測定參照GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法[16]；總糖的測定采用蒽酮比色法[17]；還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮的測定分別參照GB/T5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的菲林試劑法[18]、GB/T5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的酸堿滴定法[19]和GB/T5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》的甲醛滴定法[20]進(jìn)行；酒精度的測定采用酒精計(jì)法。
1.3.3游離氨基酸的測定
游離氨基酸的測定參照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》的方法進(jìn)行[21]。酒醪、醋醅和熏醅樣品經(jīng)蒸餾水浸提后，過濾得到的溶液定容至250mL，作為待測液。取1mL待測液用6mol/L的HCl稀釋一倍，過0.45μm濾膜后，用于氨基酸自動分析儀測定樣品中的氨基酸含量。
1.3.4有機(jī)酸的分析
有機(jī)酸的測定采用GB/T5009.157—2003《食品中有機(jī)酸的測定》中的高效液相色譜法[22]。色譜條件：SpursilC18-EP色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：20mmol/L的KH2PO4溶液（pH2.5）；流速：1mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測器：紫外檢測器，檢測波長210nm。
2結(jié)果與分析
2.1發(fā)酵階段淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力變化
淀粉酶、糖化酶和蛋白酶是參與谷物食醋釀造的主要酶類，本實(shí)驗(yàn)對酒精和醋酸發(fā)酵過程中這幾種酶的活力進(jìn)行了檢測，山西老陳醋在傳統(tǒng)工藝的酒精發(fā)酵（1～16d）與醋酸發(fā)酵（17～25d）過程中，淀粉酶和糖化酶的活力較高，最高分別為438.94U/g和257.23U/g，而酸性和中性蛋白酶活力較低，分別只有64.56U/g和27.40U/g。4種酶活在酒精和醋酸發(fā)酵階段略有變化但基本穩(wěn)定，且酒精發(fā)酵階段的酶活明顯高于醋酸發(fā)酵階段，這與醋酸發(fā)酵階段加入了麩皮和谷糠的稀釋作用有關(guān)，也可能與此階段大量產(chǎn)生醋酸有關(guān)。
2.2發(fā)酵及熏蒸過程中的變化
對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中水分、淀粉、總糖、還原糖、酒精度、總酸、氨基態(tài)氮等的變化進(jìn)行了分析，在醋酸發(fā)酵階段（17～25d），水分含量穩(wěn)定在62%～63%，淀粉由35.10%下降至27.48%（干質(zhì)量），總糖含量從2.28%增加至7.35%，還原糖含量從4.70%增加至8.54%，總酸在第22天達(dá)到最高，為10.23%。在此階段，淀粉酶和糖化酶仍有一定活力（圖1），可將淀粉繼續(xù)水解為糖，但醋酸菌是該階段的優(yōu)勢菌種，它能迅速氧化酒精生成乙酸，并降低pH值，抑制其它微生物生長，因此糖類物質(zhì)被利用較少，含量均略有增加。酒精在醋酸菌作用下迅速轉(zhuǎn)化為醋酸，至第22天已檢測不到；對應(yīng)地總酸含量在第22天達(dá)到最高不再增加。由于醋酸發(fā)酵階段蛋白酶的活力很低（圖1），所以蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量變化很小。熏蒸（27～31d）是一個(gè)加熱的過程，水分由于蒸發(fā)作用而明顯降低（64.2%～57.2%）；淀粉由于加熱和有機(jī)酸存在，由27.65%下降至18.88%（干質(zhì)量）；因美拉德反應(yīng)，還原糖和氨基酸含量分別由7.75%和0.41%下降至2.91%和0.28%；總糖略有減少，脂肪和蛋白質(zhì)含量基本不變，總酸含量增加，但不明顯。
2.3發(fā)酵及熏蒸過程中氨基酸的變化在傳統(tǒng)山西老陳醋的在酒精與醋酸發(fā)酵
以及熏蒸過程中能檢測到至少20種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，各種氨基酸含量的變化趨勢大致可以歸納為：酒精發(fā)酵過程中有不同程度的增加，醋酸發(fā)酵過程中變化不大，熏蒸階段有不同程度的降低。結(jié)合圖1的結(jié)果，在酒精發(fā)酵階段氨基酸的增加主要是蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的，所以除賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸外，其他氨基酸含量均有所增加。而賴氨酸、組氨酸和鳥氨酸含量減少，主要是這些氨基酸在高粱等谷物蛋白中總量較少[24]，同時(shí)參與微生物（如酵母菌）菌體生長代謝所致。在醋酸發(fā)酵過程中，蛋白酶活力降低，而氨基酸仍需參與微生物（如醋酸菌）菌體的生長代謝，因此，含量較高的氨基酸變化較小，含量較低的氨基酸（如賴氨酸）顯著降低。在熏蒸過程中，由于氨基酸和還原糖的美拉德反應(yīng)，因此，各種氨基酸的含量均有所降低。
2.4發(fā)酵及熏蒸過程中有機(jī)酸的變化分析
酸味物質(zhì)是食醋中的主要組成成分，有機(jī)酸是酸味的主要來源，其種類、含量及其相互比例與食醋的質(zhì)量密切相關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)采用師晶晶[5]建立的山西老陳醋中有機(jī)酸的分析方法，對傳統(tǒng)山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙酸、檸檬酸和琥珀酸等有機(jī)酸進(jìn)行了測定，醋酸和乳酸是傳統(tǒng)山西老陳醋生產(chǎn)過程中含量變化最大的兩種有機(jī)酸。在酒精發(fā)酵過程中，乳酸是主要的有機(jī)酸，醋酸含量在酒精發(fā)酵初期也有所增加。醋酸發(fā)酵前期，醋酸含量增加明顯，后期（22～25d）基本保持不變，從工藝改良的角度出發(fā)，醋酸發(fā)酵的時(shí)間可縮短到第22天，總發(fā)酵時(shí)間可縮短4d。由于酒精發(fā)酵的4～16d主要是厭氧發(fā)酵，因此乳酸菌能產(chǎn)生大量乳酸。這與吳佳佳[23]從山西老陳醋的發(fā)酵酒醪中分離到了很多乳酸菌，并隨著酒精發(fā)酵時(shí)間延長，乳酸菌的種類增多的結(jié)果相吻合。在醋酸發(fā)酵階段，由于麩皮、谷糠添加的稀釋作用，在初期（17d）醋酸和乳酸含量迅速降低，但由于醋酸菌的接入和通氣量的增加，酒精轉(zhuǎn)化成醋酸，使醋酸的含量快速上升，成為最主要的有機(jī)酸。而在熏蒸階段醋酸和乳酸的含量均略有升高。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機(jī)酸，在整個(gè)生產(chǎn)過程中，基本呈現(xiàn)先升高，后降低，再升高的趨勢。在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸的含量增加，這可能與微生物的發(fā)酵和熏蒸過程中水分的蒸發(fā)有關(guān)。丙酸在第3天時(shí)含量達(dá)到10.47mg/g，隨后降低；第17天向酒醪中添加麩皮和谷糠，丙酸含量明顯升高，這可能是因?yàn)樘畛淞蠋肓艘徊糠直嵩斐傻?；但?9天其含量突然降低，具體原因仍需進(jìn)一步探討，在熏蒸過程中，丙酸的含量降低。
3結(jié)論
酒精發(fā)酵階段，淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶的活力雖然呈現(xiàn)出高-低-高的趨勢，但基本穩(wěn)定。在山西老陳醋的傳統(tǒng)工藝中，曲的用量非常大（高粱與大曲質(zhì)量比為100∶62.5），大曲除了是微生物（霉菌、酵母菌、醋酸菌等）的載體外，也是酶制劑，曲中淀粉酶等水解酶迅速分解淀粉變成糖，總糖和還原糖也在酒精發(fā)酵階段的第1天最高。所以酒精發(fā)酵階段的水解酶主要來自大曲，后期酶活稍有升高，可能是霉菌等微生物生長產(chǎn)生的。在醋酸發(fā)酵階段，由于添加了麩皮和谷糠，酒醪被稀釋，同時(shí)醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，pH降低，酶活受到抑制，因此，各水解酶的活力均有所降低。由于酵母等微生物生長代謝，總糖、還原糖含量在酒精發(fā)酵階段不斷降低；而在醋酸發(fā)酵階段略有增加的原因，可能是在此階段糖化酶和淀粉酶仍具有一定的活性，可繼續(xù)水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖，而醋酸菌等微生物較少利用它們；在熏蒸階段又降低，由于還原糖和氨基酸在加熱的情況下，易發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗了糖類。酒精含量在酒精發(fā)酵的第1～11天上升，在酒精發(fā)酵后期（14～16d）保持穩(wěn)定，在醋酸發(fā)酵第4天時(shí)檢測不出，酒精發(fā)酵的時(shí)間可縮短2d?？偹岷繌牡?～22天增加，而從第23～31天其含量變化不明顯。氨基酸在酒精發(fā)酵過程中含量明顯增加，此階段蛋白酶的活力較強(qiáng)，能分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸；氨基酸含量在醋酸發(fā)酵過程中變化較小，此階段蛋白酶活力顯著降低，能少量分解蛋白質(zhì)生成氨基酸；熏蒸過程中氨基酸含量有不同程度的降低，由于氨基酸和還原糖在加熱的條件下易發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗了氨基酸。醋酸是山西老陳醋中的主要成分，在醋酸發(fā)酵前期和熏蒸過程中含量明顯增加，在醋酸發(fā)酵后期（22～25d）基本保持不變，醋酸發(fā)酵的時(shí)間可縮短到第22天，總發(fā)酵時(shí)間可縮短6d。乳酸主要在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生，在醋酸發(fā)酵和熏蒸過程中變化較小。其他有機(jī)酸在發(fā)酵及熏蒸過程中含量較低，變化較小。
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作者:陳濤 桂青 郭俊陸 王正剛 陳福生 單位:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所 山西老陳醋集團(tuán)有限公司 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室