自薦信標(biāo)題精選(九篇)

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第1篇：自薦信標(biāo)題范文

【關(guān)鍵詞】五個對接 電子 課程體系

教育部在關(guān)于大力發(fā)展職業(yè)教育的決定中指出，職業(yè)教育要實現(xiàn)五個對接：即專業(yè)與產(chǎn)業(yè)對接，課程內(nèi)容與職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對接，教學(xué)過程與生產(chǎn)過程對接，學(xué)歷證書與職業(yè)資格證書對接，職業(yè)教育與終身學(xué)習(xí)對接。為此，我們積極開展教改嘗試，這里筆者將我校電子電器應(yīng)用與維修專業(yè)（以下簡稱電子專業(yè)）在課程改革中的嘗試和實際做法作簡要介紹，以期起到拋磚引玉的作用。

1.以市場調(diào)研為基礎(chǔ) 找準(zhǔn)專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)

為了更好地確立電子專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)，構(gòu)建與行業(yè)、企業(yè)人才需求和就業(yè)崗位相適應(yīng)的課程體系、課程標(biāo)準(zhǔn)，我們在2011年下期組織了電子專業(yè)專業(yè)課教師開展了廣泛的行業(yè)、企業(yè)調(diào)研。調(diào)研了海爾、格力、TCL 、四川凱越光電、柏獅光電以及當(dāng)?shù)囟嗉壹译娋S修店、四川職業(yè)學(xué)院、航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院等16家大中型企業(yè)和單位。調(diào)查涉及電子電器制造、產(chǎn)業(yè)和維修、銷售等領(lǐng)域。調(diào)查的對象有一線員工、畢業(yè)學(xué)生、班組長、車間主任、部門經(jīng)理、人力資源部長、企業(yè)老總等，我們通過發(fā)放調(diào)查表、深入企業(yè)考察、與負(fù)責(zé)人和員工交談等形式，了解企業(yè)對人才的需求狀況、中職學(xué)生畢業(yè)后從事的職業(yè)崗位、企業(yè)對中職學(xué)生的知識、專業(yè)技能、職業(yè)素養(yǎng)等方面的要求及中職生今后的升遷途徑，獲得了寶貴的第一手資料。為確立本專業(yè)的人才培養(yǎng)目標(biāo)、專業(yè)課程設(shè)置、確定學(xué)科課程標(biāo)準(zhǔn)提提供了重要依據(jù)。我們通過對調(diào)查情況詳細(xì)分析，并經(jīng)過分類、歸納、總結(jié)，形成了電子專業(yè)的市場調(diào)研報告，確立了本專業(yè)的人才培養(yǎng)目標(biāo)：本專業(yè)主要面向電子電器生產(chǎn)、銷售和維修企業(yè)，培養(yǎng)德、智、體、美全面發(fā)展，具有良好的職業(yè)道德、職業(yè)安全意識和踏實認(rèn)真的工作態(tài)度，在產(chǎn)品生產(chǎn)、服務(wù)、經(jīng)營和管理第一線工作的具有從事電子電器產(chǎn)品裝配、檢驗、調(diào)試、維修能力的初、中級技能型人才，并為高一級學(xué)校輸送人才。通過調(diào)研，專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)更加切合中職學(xué)生實際、企業(yè)需求，更能體現(xiàn)人才成長的需要。

2.改革課程結(jié)構(gòu) 創(chuàng)新育人模式

根據(jù)教育部《關(guān)于進(jìn)一步深化中等職業(yè)教育教學(xué)改革的若干意見》文件精神，為更好地適應(yīng)行業(yè)、企業(yè)對人才結(jié)構(gòu)需求，根據(jù)本專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)，我們構(gòu)建了"232"課程體系。即：就業(yè)教育與升學(xué)教育兩條腿走路即"2"；課程結(jié)構(gòu)分為三類：公共基礎(chǔ)課、專業(yè)技能課、企業(yè)實習(xí)課，并開設(shè)三個專門化方向"3"；課程內(nèi)容實現(xiàn)與雙證書對接，即"2"。

我們將本專業(yè)的課程分為三大類型：

一類為公共基礎(chǔ)課。包括語文、數(shù)學(xué)、英語、德育、體育、計算機(jī)、禮儀等，著重培養(yǎng)學(xué)生基本文化素養(yǎng)，促進(jìn)學(xué)生可持續(xù)發(fā)展。

一類為專業(yè)技能課。專業(yè)技能課采用基礎(chǔ)平臺加專業(yè)門化方向的課程結(jié)構(gòu)：電子電器應(yīng)用與維修專業(yè)開設(shè)電工技術(shù)基礎(chǔ)與技能、電子技術(shù)基礎(chǔ)與技能、單片機(jī)技術(shù)應(yīng)用等基礎(chǔ)平臺課。開設(shè)三個專業(yè)門化方向，即：電子產(chǎn)品裝配方向、家電維修方向和維修電工方向。專業(yè)技能課著重培養(yǎng)學(xué)生從事企業(yè)崗位的職業(yè)能力和轉(zhuǎn)崗的能力。

第三類為企業(yè)實習(xí)課。我們將教育部規(guī)定的頂崗實習(xí)一年分散到各學(xué)期：第一學(xué)期軍訓(xùn)一周、企業(yè)見習(xí)一周，著重培養(yǎng)學(xué)生國防意識、愛國愛黨愛軍隊的思想品質(zhì)、訓(xùn)練學(xué)生遵章守紀(jì)、一切行動聽指揮、適應(yīng)集體生活，增強(qiáng)對企業(yè)感性認(rèn)識，了解企業(yè)、了解專業(yè)；第二學(xué)期末至第三學(xué)期初（主要利用寒暑假），學(xué)生到企業(yè)參加四個月企業(yè)實踐活動，培養(yǎng)學(xué)生吃苦耐勞精神、體驗企業(yè)文化、企業(yè)管理、體會掙錢艱辛，通過實習(xí)還可掙回近三年學(xué)費，并讓學(xué)生過一個有意義的假期；第四學(xué)期和第五學(xué)期，學(xué)生分別到企業(yè)專業(yè)對口實習(xí)兩周，熟悉企業(yè)、熟悉工作崗位、增強(qiáng)專業(yè)技能；第六學(xué)期，學(xué)生到企業(yè)頂崗實習(xí)一學(xué)期，強(qiáng)化技能、實現(xiàn)學(xué)生到技術(shù)工人身份的轉(zhuǎn)換，為就業(yè)打下堅實基礎(chǔ)。

在三年中，各專業(yè)三類課程比例大體相當(dāng)，文化基礎(chǔ)課1154學(xué)時，專業(yè)技能課1220學(xué)時，實習(xí)課累計1320學(xué)時，各約占三分之一。調(diào)整后的課程結(jié)構(gòu)既實現(xiàn)了教育部提出的中等職業(yè)教育學(xué)制三年，其中在企業(yè)頂崗實習(xí)累計一年的要求，也更加符合中職生從學(xué)生向技術(shù)工人轉(zhuǎn)換的成長特點。

3.按企業(yè)要求設(shè)置課程，實現(xiàn)專業(yè)與產(chǎn)業(yè)的對接

學(xué)校與廣東大東俊通、重慶海爾集團(tuán)、格力電器、富士機(jī)電、四川凱越光電等多家企業(yè)和區(qū)域多家家電維修店簽定了校企合作、定單培訓(xùn)協(xié)議。我們成立了專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)委員會，與聯(lián)辦企業(yè)共同制定專業(yè)培訓(xùn)計劃，確定培訓(xùn)內(nèi)容；企業(yè)定期接受實習(xí)學(xué)生；學(xué)校聘請工程師、技術(shù)員到校上課等。比如，去年春節(jié)以來，我校與海爾集團(tuán)聯(lián)合招收了四個"海爾班"共計200余人。我們按海爾集團(tuán)的要求，調(diào)整了課程結(jié)構(gòu)，融入了海爾文化、加強(qiáng)了維修電工、制冷設(shè)備原理與維修的學(xué)習(xí)等內(nèi)容；學(xué)校聘請了海爾集團(tuán)的工程師陳元等4人作為電子電器應(yīng)用與維修專業(yè)的專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)委員會委員和兼職教師；海爾集團(tuán)從一年級開始每期安排企業(yè)工程師到校上課，并將根據(jù)教學(xué)進(jìn)度，向?qū)W校提供海爾冰箱、空調(diào)、熱水器等生產(chǎn)器件作為電子專業(yè)學(xué)生校內(nèi)實習(xí)的實訓(xùn)設(shè)備設(shè)施和器材；還為聯(lián)辦班學(xué)生設(shè)置了獎學(xué)金。學(xué)校還多次組織召開了專業(yè)建設(shè)指導(dǎo)委員會會議，積極聽取行業(yè)企業(yè)專家、工程師對專業(yè)建設(shè)、課程教學(xué)、校企合作、頂崗實習(xí)等方面建議和意見。去年4月份以來學(xué)校先后安排了10春、10秋電子班70余名學(xué)生到重慶海爾集團(tuán)頂崗實習(xí)。在去年春節(jié)和今年暑假，學(xué)校安排了10秋、11春、11秋和三個年級的學(xué)生到大東俊通電子有限公司進(jìn)行了為期四個月的短期實習(xí)，實習(xí)學(xué)生實習(xí)結(jié)束后再全部回校學(xué)習(xí)，掙回實習(xí)工資平均達(dá)8000余元。

4.構(gòu)建"理實一體化"教學(xué)模式，實習(xí)教學(xué)過程與生產(chǎn)過程對接

以往的課程，重理論，輕實踐，學(xué)科性質(zhì)濃厚，理論、實踐分割嚴(yán)重。為體現(xiàn)職業(yè)教育的特點，我們對傳統(tǒng)學(xué)科課程進(jìn)修了整合，將理論實踐融為一體。我們將電子專業(yè)原來四門基礎(chǔ)課課程《電工技術(shù)基礎(chǔ)》、《電工技能》、《電子技術(shù)基礎(chǔ)》、《電子技能》整合為兩門課程《電工技術(shù)基礎(chǔ)與技能》、《電子技術(shù)基礎(chǔ)與技能》；將《電子測量》、《材料與元件》、《電子產(chǎn)品結(jié)構(gòu)工藝》三門課程整合為一門課程《電子產(chǎn)品裝配與調(diào)試》。為了進(jìn)一步適應(yīng)中職生學(xué)習(xí)特點，貫徹"教、學(xué)、做"合一的教學(xué)理念，我們從去年12月開始，組織教師編寫"理、實一體化"教材，如《電工技術(shù)基礎(chǔ)與技能訓(xùn)練》、《電子技術(shù)基礎(chǔ)與技能訓(xùn)練》等，這些課程打破傳統(tǒng)的陳述式性質(zhì)的教材體系，克服重理論輕實踐、重視知識的系統(tǒng)性輕應(yīng)用性等缺點，按"做中學(xué)、做中教"的指導(dǎo)思想，先實踐、后理論和先感性后理性的認(rèn)知規(guī)律來組合教學(xué)內(nèi)容，并將實踐課融合到各章各節(jié)中，同時還配備了大量實物圖片、教學(xué)課件、仿真軟件等來加強(qiáng)直觀性教學(xué)。目前，這些教材分別由高教社和北京理工大學(xué)出版社出版。

為了使教學(xué)過程更加貼近真實生產(chǎn)環(huán)境，我們以工作過程導(dǎo)向，組織專業(yè)教師、行業(yè)企業(yè)專家編寫了技能實訓(xùn)項目教材如《電子產(chǎn)品裝配與調(diào)試》、《維修電工》、《電視機(jī)原理與維修》、《電熱電動器具原理與維修》等。還在全校推行項目教學(xué)法：學(xué)生每完成一個實訓(xùn)項目，都將制作一件可以看得見的產(chǎn)品或作品。這樣，教學(xué)環(huán)境更加貼近真實生產(chǎn)環(huán)境，更有利于培養(yǎng)學(xué)生職業(yè)崗位意識、職業(yè)道德和職業(yè)職業(yè)素養(yǎng)。

5.改革課程內(nèi)容，實現(xiàn)學(xué)歷證書與職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的銜接

為了實現(xiàn)學(xué)歷證書與職業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的對接，我們積極推行"雙證書"制度，并改革專業(yè)各學(xué)科課程內(nèi)容。為了讓學(xué)生既能獲得畢業(yè)證，又能考取職業(yè)技能等級證，我們在課程上加強(qiáng)了與職業(yè)工種的對接：如《電工技術(shù)基礎(chǔ)與技能》、《維修電工》對接維修電工初、中級工；《電子技術(shù)基礎(chǔ)與技能》、《電子CAD》、《電子產(chǎn)品裝配與調(diào)試》對接無線電裝接工初、中級；《電熱電動器具原理與維修》、《電視機(jī)原理與維修》、《制冷設(shè)備原理與維修》對接家用電器維修工及制冷設(shè)備維修工初、中級。這樣，電子專業(yè)學(xué)生就可以考取無線電裝接工、維修電工、家用電器維修工或制冷設(shè)備維修工等工種等初、中級技能等級證書。同時在課程標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置上參照各工種應(yīng)知應(yīng)會標(biāo)準(zhǔn)確定科長目標(biāo)和教學(xué)內(nèi)容。教師們按照初級工、中級工的應(yīng)知應(yīng)會標(biāo)準(zhǔn)開展教學(xué)，使教學(xué)做到有的放矢。從二年級開始，我們每期開展一次職業(yè)技能鑒定培訓(xùn)和職業(yè)技能鑒定考試，這樣至畢業(yè)時，絕大多數(shù)學(xué)生均可考取1-2各工種的技能等級證書，專業(yè)雙證制比例達(dá)97%以上。我校電子專業(yè)課程設(shè)置與職業(yè)技能鑒定工作的關(guān)系如下：

6.探索中高職銜接機(jī)制，構(gòu)建人才成長立交橋

以前的中職教育，過分強(qiáng)調(diào)就業(yè)教育，把中職教育辦成了終極教育，導(dǎo)致學(xué)生無希望、沒追求，不利于學(xué)生的成長和終身發(fā)展，也使得職業(yè)教育越來越缺乏吸引力。為了打通人才成長的立交橋，我們一方面提出了向高一級學(xué)校輸送人才的專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)，把學(xué)生在校時間由原來的四學(xué)期調(diào)整為五學(xué)期，第六學(xué)期一部分學(xué)生到企業(yè)頂崗實習(xí)，一部分留下繼續(xù)學(xué)習(xí)參加高職對口單招考試或?qū)谏龑W(xué)考試；另一方面調(diào)整課程結(jié)構(gòu)，在專業(yè)課程設(shè)置中加入了高職對口升學(xué)課程。比如，電子專業(yè)開設(shè)的《電工技術(shù)基礎(chǔ)與技能》、《電子技術(shù)基礎(chǔ)與技能》、《單片機(jī)及應(yīng)用》是目前四川省高職對口升學(xué)必考內(nèi)容。第三是積極探索中高職的銜接機(jī)制，今年我們與四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院等高職院校建立了中高職銜接試點班：與高職教師一起研究研究了試點班課程設(shè)置和課程內(nèi)容，確定了哪些知識技能在中職階段上，哪些知識技能在高職上；還與高職學(xué)校的老師一起編寫中高職銜接課程大綱和銜接教材；學(xué)生的學(xué)習(xí)成績每期上報高職院校；按計劃定期聘請高職院校教師到學(xué)校上課等。目前，電子專業(yè)學(xué)生基本形成了就業(yè)班、對口升學(xué)班、中高職銜接試點班各占三分之一的格局。

近兩年的課程改革帶來了豐碩成果。2012年電子近200多學(xué)生畢業(yè)，其中升學(xué)本科院校22人、職業(yè)技術(shù)學(xué)院45人，其余學(xué)生全部推薦到大、中型企業(yè)工作，一次就業(yè)率大95%以上，對口就業(yè)達(dá)70%。2013年參加全市中職生技能競賽，學(xué)校獲團(tuán)體一等獎；電子專業(yè)被省教廳推薦代表四川參加全國中職生電器設(shè)備安裝與維修工作技能競賽。通過行的課程改革，教師樂教、學(xué)生樂學(xué)、教材易懂、易學(xué)，學(xué)風(fēng)、教風(fēng)空前濃厚，也有力推動了整個學(xué)校教育教學(xué)質(zhì)量的提升。

第2篇：自薦信標(biāo)題范文

關(guān)鍵詞：DNA 計算；分子信標(biāo)；NP\完全問題；Hamilton圈

中圖分類號：O157.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1672-1098（2016）01-0030-04

Abstract： In order to solve the classical problems in graph theory and develop a new molecular structure by using DNA， based on the principle that different forms of fluorescent molecular-quenching molecular in the molecular beacon constitutes multi color molecular beacon， the detection model for the solution of Hamilton circle， the NP\complete problem， was given. The model has the advantages of simple encoding， low complexity， easy to detect and so on.

Key words：DNA computing； molecular beacon； NP\complete problem； Hamilton circle

1994年，文獻(xiàn)[1]首次在實驗室用DNA分子解決了一個含有7個城市的Hmilton有向路問題，自此，誕生了一個新的研究領(lǐng)域――DNA計算。1996年，文獻(xiàn)[2]首次建立分子信標(biāo)（molecularbeacon，MBs）探針，其作為一種新型的熒光探針在近年來得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[3-6]。

繼Adleman博士的著名實驗之后，有關(guān)Hmilton路的一些其他問題的DNA計算也取得了一些進(jìn)展[7-8]。除了在電子計算機(jī)和DNA計算機(jī)上的算法研究外，部分學(xué)者還在理論上對Hmilton問題進(jìn)行了一定的討論[9]。通過選擇不同的熒光分子-猝滅分子對可以設(shè)計出不同熒光的分子信標(biāo)（稱多色分子信標(biāo)），每個分子信標(biāo)與其各自的靶標(biāo)序列雜交后，會釋放不同顏色的熒光，此時，通過熒光檢測系統(tǒng)檢測不同的顏色來解決問題，這樣可以使多個靶核苷酸同時定量測定且加以區(qū)別，本文基于上述原理設(shè)計了一個Hmilton圈問題解的檢測模型。

關(guān)于Hmilton問題的部分?jǐn)?shù)學(xué)描述如下：包含圖G的每個頂點的路稱為G的Hmilton路；包含圖G的每個頂點的圈稱為G的Hmilton圈；一個圖包含HaInilton圈，則稱這個圖是Hmilton圖。對于n階圖G，如果G含長度是n的圈，則稱G是Hamilton圖[10]。Hmilton圈問題是圖論最古老的研究課題之一，是至今未解決的世界難題，在許多領(lǐng)域有著重要應(yīng)用，同時，它也是一個典型的NP-完全問題。

1分子信標(biāo)原理

分子信標(biāo)是一種設(shè)計巧妙的新型熒光探針，主要由環(huán)和莖桿部分組成。環(huán)上的寡聚核苷酸序列是分子信標(biāo)的基因識別區(qū)，它能與靶基因自發(fā)地進(jìn)行雜交；莖部是一段5～8mer序列互補(bǔ)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在分子信標(biāo)的5’端和3’端通過連接臂連接上熒光素和猝滅劑。一般用EDANS（1一氨基萘一8一羧酸）為熒光素，用DABCYL（二甲氨基偶氮苯甲酰）為猝滅劑（見圖1）。當(dāng)莖桿部分解鏈后“發(fā)夾”就會打開從而變成單鏈分子。在原始狀態(tài)下，分子信標(biāo)呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)熒光分子與猝滅分子靠近（約為7～10 nm），即可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時，熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，檢測不到熒光信號。分子信標(biāo)的工作原理如圖2所示，當(dāng)有靶序列存在時，分子信標(biāo)的環(huán)部即可與靶序列特異性結(jié)合，形成的雙鏈比分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，熒光分子與猝滅分子分開，熒光分子發(fā)出的熒光不能被猝滅分子吸收，這時可檢測到熒光，且所檢測到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比。本模型利用金屬納米簇作猝滅劑，通過調(diào)節(jié)金屬簇的大小、形狀和組成而得到不同種的熒光，形成多色分子信標(biāo)用于同時定量標(biāo)記。

2） 由步驟1得到通過圖G中的所有頂點的可能路徑集，由于使用的分子信標(biāo)探針P0，P1，P2，P3，P4，P5的熒光不同，可通過熒光檢測系統(tǒng)檢測出帶有（且僅帶有）這六種熒光的鏈，并保留。此時，便得到了通過圖G中的每個頂點（且一次）的路徑，即hamilton路。

32.3步驟3

以圖3a為例，根據(jù)步驟1的編碼規(guī)則，若步驟2所得片段構(gòu)成hamilton圈，其產(chǎn)物的最后必定為v0編碼的前10 bp寡聚核苷酸片段。

制作以v0前10 bp寡聚核苷酸片段互補(bǔ)序列為環(huán)部的分子信標(biāo)探針P（見圖4b），與步驟3的生成產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)，通過檢測熒光發(fā)光點的位置，判斷是否為Hamilton圈。

324步驟4

若路徑滿足上述條件，則說明存在Hamilton圈，對步驟4的結(jié)果采用非放射性標(biāo)記DNA測序的方法，進(jìn)行測序，讀出結(jié)果，否則，不存在Hamilton圈。

4結(jié)束語

分子信標(biāo)具有結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度高及易觀測等優(yōu)點，此技術(shù)在特定情況下能夠把核酸序列轉(zhuǎn)化為熒光信息。本文基于分子信標(biāo)的這些特性建立了Hamilton圈問題的分子信標(biāo)檢測模型。通過多色分子信標(biāo)同時標(biāo)記，大大減少了DNA計算的過程，具有一定的學(xué)術(shù)研究意義。此模型的復(fù)雜程度與頂點數(shù)和頂點的度有關(guān)。當(dāng)然，并非由此模型生成的混合物都是問題的解，還需要通過刪選、檢測過程進(jìn)行判斷。如果一個圖中不存在Hamilton圈，那么最后溶液中就不會生成可以表示Hamilton圈的分子。此外，DNA計算所應(yīng)用的各種生物技術(shù)自身也存在著一定誤差，尤其是PCR技術(shù)。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，這些問題將會得到完善與解決。

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第3篇：自薦信標(biāo)題范文

關(guān)鍵詞：戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè) 融資能力 評價指標(biāo)體系

一、引言

近年來，戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)成為國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展重點扶持對象，該產(chǎn)業(yè)屬于技術(shù)依賴型產(chǎn)業(yè)，具有資源能耗低、帶動系數(shù)大、就業(yè)機(jī)會多、綜合效益好、市場前景廣等特征。不過，就目前國內(nèi)該產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況來看，該類產(chǎn)業(yè)還處于初級發(fā)展階段，從外部市場到內(nèi)部管理都沒有達(dá)到一定水平，資金實力較弱，發(fā)展規(guī)模偏小，目標(biāo)市場還未成熟，擁有專利技術(shù)較少，研發(fā)人才短缺且流動性較大，產(chǎn)業(yè)化水平較低，這些問題都嚴(yán)重制約了該類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在眾多問題中，最根本問題在于該類產(chǎn)業(yè)普遍資金實力較弱，因此，解決該類產(chǎn)業(yè)資金問題是重中之重。

大部分戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)中的企業(yè)屬于中小企業(yè)，因此，該類企業(yè)具有大多數(shù)國內(nèi)中小企業(yè)的發(fā)展特點，所面臨的困難也有一定相似性，最大的相似點在于融資困難，各類金融機(jī)構(gòu)對于新興產(chǎn)業(yè)類型的企業(yè)重視度不夠，貸款程序復(fù)雜，條件較高，這些都導(dǎo)致該類企業(yè)融資困難，嚴(yán)重限制了該類企業(yè)的發(fā)展。因此，為準(zhǔn)確衡量和評價戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè)自身的融資實力，有效規(guī)避銀行放貸風(fēng)險，提高貸款資金的盈利能力，推動該類產(chǎn)業(yè)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，提升整體產(chǎn)業(yè)水平，應(yīng)從該類企業(yè)本身研究衡量其融資能力的指標(biāo)，并構(gòu)建一套完整、科學(xué)、系統(tǒng)的指標(biāo)體系。

二、戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè)融資能力評價指標(biāo)選取原則及來源

為準(zhǔn)確、客觀、系統(tǒng)地評價戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的融資能力，保證指標(biāo)選取的有效性和有用性，依據(jù)原則有：量化原則、數(shù)據(jù)可得性原則、指標(biāo)代表性原則、相對量指標(biāo)原則、動態(tài)與可持續(xù)性原則。

指標(biāo)選取來源主要結(jié)合該類企業(yè)在發(fā)展過程中面臨的各項風(fēng)險來選擇確定，這些風(fēng)險包括：

第一，技術(shù)風(fēng)險。由于該類產(chǎn)業(yè)屬于技術(shù)依賴型，而現(xiàn)階段國內(nèi)相關(guān)技術(shù)都還在起步階段，在技術(shù)研發(fā)過程中可能會存在如技術(shù)研發(fā)周期較長、技術(shù)研發(fā)失敗、研發(fā)機(jī)構(gòu)的合作關(guān)系中斷、先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用性較小、科技轉(zhuǎn)化率低等問題，這些問題都嚴(yán)重制約了該類企業(yè)的發(fā)展。

第二，市場風(fēng)險。由于戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)在我國還屬于新興產(chǎn)業(yè)，市場需求還沒有足夠開發(fā)，或者說市場需求不夠旺盛，盲目放貸給該類企業(yè)可能會導(dǎo)致供需失衡、產(chǎn)能過剩等后果。因此，該類企業(yè)的市場風(fēng)險往往也比較大。

第三，財務(wù)風(fēng)險。受市場環(huán)境影響，該類企業(yè)初期經(jīng)營績效往往不會太好，這會嚴(yán)重影響到企業(yè)經(jīng)營收益情況，如果企業(yè)不能持續(xù)盈利，現(xiàn)金流斷裂會使企業(yè)未來發(fā)展陷入僵局。

第四，宏觀政策風(fēng)險。這些政策風(fēng)險主要來自于國家的財稅政策、技術(shù)政策、行業(yè)扶持政策。一旦國家發(fā)揮“看得見的手”的作用，對該類產(chǎn)業(yè)扶持力度加大，那么就會引起該類產(chǎn)業(yè)水平整體提升，盈利能力增強(qiáng)，市場逐步擴(kuò)大，而如果國家放棄扶持，那么其發(fā)展速度會受到嚴(yán)重制約。因此，國家的相關(guān)政策在該類產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。

三、戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè)融資能力評價指標(biāo)體系內(nèi)容

通過分析研究該類企業(yè)存在風(fēng)險，結(jié)合實際發(fā)展情況，本文構(gòu)建技術(shù)指標(biāo)、財務(wù)指標(biāo)和宏觀環(huán)境指標(biāo)三個一級指標(biāo)，并分設(shè)二級、三級指標(biāo)來全面衡量評價該類企業(yè)的融資能力。

1.技術(shù)指標(biāo)

（1）研發(fā)實力指標(biāo)

①企業(yè)研發(fā)人員數(shù)量比值=研發(fā)人員總數(shù)/企業(yè)員工總數(shù)；

②企業(yè)研發(fā)人員結(jié)構(gòu)比值=研發(fā)人員中各類學(xué)歷人數(shù)/企業(yè)研發(fā)人員總數(shù)；

③企業(yè)研發(fā)經(jīng)費投入比重=當(dāng)年研發(fā)經(jīng)費總額/企業(yè)當(dāng)年各項經(jīng)費總額；

④企業(yè)引進(jìn)人才投入比重=（研發(fā)人才引入成本+研發(fā)人才培養(yǎng)成本）/ 人力資源總成本；

⑤企業(yè)研發(fā)合作投入比重=企業(yè)與外單位合作研發(fā)經(jīng)費投入額/企業(yè)科研經(jīng)費投入總額。

（2）技術(shù)實力指標(biāo)

①自有技術(shù)項目數(shù)量比值=企業(yè)自主研發(fā)專利技術(shù)數(shù)量/企業(yè)技術(shù)總數(shù)；

②引進(jìn)技術(shù)項目數(shù)量比值=企業(yè)引進(jìn)技術(shù)項目數(shù)量/企業(yè)技術(shù)總數(shù)；

③企業(yè)專利產(chǎn)出比率=企業(yè)在某技術(shù)領(lǐng)域的專利申請量 / 該技術(shù)領(lǐng)域所有專利申請量的比例；

④企業(yè)科技論文產(chǎn)出比率=企業(yè)當(dāng)年科技數(shù)量/行業(yè)當(dāng)年科技總數(shù)；

⑤企業(yè)技術(shù)市場成交率=企業(yè)在技術(shù)市場中成交合同金額/企業(yè)當(dāng)年科研經(jīng)費總額；

⑥企業(yè)配套技術(shù)數(shù)量比值=企業(yè)配套技術(shù)數(shù)量/企業(yè)技術(shù)總數(shù)。

2.財務(wù)指標(biāo)

（1）盈利能力指標(biāo)

①主營業(yè)務(wù)利潤率=利潤/主營業(yè)務(wù)收入凈額；

②資產(chǎn)凈利率=凈利潤/平均資產(chǎn)總額；

③凈資產(chǎn)收益率=凈利潤/平均凈資產(chǎn)；

④成本費用利用率=利潤總額/成本費用總額。

（2）營運能力指標(biāo)

①應(yīng)收賬款周轉(zhuǎn)率是指應(yīng)收賬款周轉(zhuǎn)次數(shù)，即賒銷凈額/應(yīng)收賬款平均余額；和應(yīng)收賬款周轉(zhuǎn)天數(shù)，即日歷天數(shù)/應(yīng)收賬款周轉(zhuǎn)次數(shù)；

②存貨周轉(zhuǎn)率包括存貨周轉(zhuǎn)次數(shù)，即銷貨成本/存貨平均余額；存貨周轉(zhuǎn)天數(shù)，即日歷天數(shù)/存貨周轉(zhuǎn)次數(shù)；

③流動資產(chǎn)周轉(zhuǎn)率，即流動資產(chǎn)周轉(zhuǎn)次數(shù)=流動資產(chǎn)周轉(zhuǎn)額/流動資產(chǎn)平均占用額；

④總資產(chǎn)周轉(zhuǎn)率，包括總資產(chǎn)周轉(zhuǎn)次數(shù)，即產(chǎn)品銷售收入/資產(chǎn)平均總額；總資產(chǎn)周轉(zhuǎn)天數(shù)，即日歷天數(shù)/總資產(chǎn)周轉(zhuǎn)次數(shù)。

（3）發(fā)展能力

①營業(yè)收入增長率=（當(dāng)年營收額-上年營收額）/上年營收額；

②資本保值增值率=扣除客觀因素后的本年末所有者權(quán)益總額/年初所有者權(quán)益總額；

③總資產(chǎn)增長率=當(dāng)年總資產(chǎn)增長額/年初資產(chǎn)總額；

④營業(yè)利潤增長率=當(dāng)年營業(yè)利潤增長額/上年營業(yè)利潤總額；

⑤市場份額增長率=（當(dāng)年市場份額-上年市場份額）/ 上年市場份額。

（4）財務(wù)抗風(fēng)險能力

該類企業(yè)的財務(wù)風(fēng)險主要從企業(yè)自身的償債能力來評價。

①流動比率=流動資產(chǎn)/流動負(fù)債；

②速動比率=速動資產(chǎn)/流動負(fù)債；

③資產(chǎn)負(fù)債率=負(fù)債總額/資產(chǎn)總額

④資本負(fù)債率=負(fù)債總額/所有者權(quán)益總額

⑤無形資產(chǎn)負(fù)債率=負(fù)債總額/無形資產(chǎn)

⑥稅費占營運資金比率=企業(yè)繳納稅費總額/（流動資產(chǎn)-流動負(fù)債）

⑦利息保障倍數(shù)=EBIT/利息費用

3.宏觀環(huán)境指標(biāo)

（1）政策法律環(huán)境指標(biāo)

①科技資金占財政總支出比例=當(dāng)?shù)卣斦萍紦芸?當(dāng)?shù)卣斦傊С觯?/p>

②政府支撐政策條款數(shù)量是指政府在相關(guān)政策條例中所規(guī)定的對該類產(chǎn)業(yè)的支撐條款數(shù)量；

③企業(yè)科技研發(fā)經(jīng)費中政府資金占比=政府科技投入資金/企業(yè)總研發(fā)經(jīng)費；

④稅收減免幅度=（某項新實施稅率-舊實施稅率）/舊實施稅率；

⑤政府為該類企業(yè)提供擔(dān)保數(shù)量是指當(dāng)?shù)卣疄樵擃惼髽I(yè)提供擔(dān)保的企業(yè)總數(shù)；

⑥知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)條款數(shù)量是指國家法律法規(guī)條款中保護(hù)該類產(chǎn)業(yè)知識產(chǎn)權(quán)的條款數(shù)量。

（2）市場環(huán)境指標(biāo)

①目標(biāo)市場人均收入水平主要反映目標(biāo)市場是否有足夠能力支持該類企業(yè)的產(chǎn)品或服務(wù)；

②目標(biāo)市場恩格爾系數(shù)=目標(biāo)市場食品支出總額/個人消費支出總額

③該類產(chǎn)業(yè)對GDP貢獻(xiàn)率=行業(yè)產(chǎn)值/GDP總量

④市場潛在需求量主要反映該類產(chǎn)業(yè)是否有足夠市場需求，該指標(biāo)涉及到該類產(chǎn)業(yè)是否能長足發(fā)展；

⑤該行業(yè)銷售額增長率=（當(dāng)年行業(yè)總銷售額-上年行業(yè)總銷售額）/上年行業(yè)總銷售額。

（3）技術(shù)環(huán)境指標(biāo)

①行業(yè)研發(fā)經(jīng)費投入比值=行業(yè)研發(fā)經(jīng)費投入額/行業(yè)總投入額

②行業(yè)技術(shù)成果轉(zhuǎn)化率=已產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)成果數(shù)量/行業(yè)技術(shù)成果總量

③行業(yè)技術(shù)引進(jìn)消化吸收率=消化吸收的技術(shù)數(shù)量/引進(jìn)技術(shù)總量

④行業(yè)技術(shù)市場成交率=技術(shù)市場成交合同金額/研發(fā)經(jīng)費支出

⑤技術(shù)人才流動率=年技術(shù)人才流動量/總?cè)瞬艛?shù)量

⑥萬人發(fā)明專利擁有量=年末發(fā)明專利擁有量/年末總?cè)丝?，指每萬人擁有經(jīng)國內(nèi)外知識產(chǎn)權(quán)行政部門授權(quán)且在有效期內(nèi)的發(fā)明專利件數(shù)。是衡量一個國家或地區(qū)科研產(chǎn)出質(zhì)量和市場應(yīng)用水平的綜合指標(biāo)。

四、結(jié)論與不足

通過對戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè)融資能力評價指標(biāo)體系的構(gòu)建，為金融機(jī)構(gòu)特別是銀行明確了放貸標(biāo)準(zhǔn)，為有效評價其貸款安全性和盈利性打下堅實基礎(chǔ)，初步保證銀行貸款安全、可靠，同時，對于該類企業(yè)，可以使其結(jié)合自身實際經(jīng)營發(fā)展情況從以上這些指標(biāo)著手逐步培養(yǎng)自身的融資能力，提高未來獲得銀行資金支持的可能性。不過，戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)類企業(yè)雖然有共同之處，但是由于涉及行業(yè)有七項，而以上提出的指標(biāo)只是針對共性提出的，對于行業(yè)特殊性方面，并未能完全體現(xiàn)，因此，還應(yīng)在實際考察某項具體行業(yè)企業(yè)時，結(jié)合行業(yè)特點補(bǔ)充或者減少具體評價指標(biāo)的項目。

參考文獻(xiàn)：

[1]王佩，李蕓. 企業(yè)融資能力與融資行為分析[J]. 經(jīng)濟(jì)師，2001（9）

[2]孫威武. 企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目風(fēng)險評價[J]. 中南財經(jīng)政法大學(xué)學(xué)報，2004（1）

[3]潘奇才，劉鐵兵. 高技術(shù)企業(yè)綜合水平的評價方法研究[J]. 科研管理，1996（1）

第4篇：自薦信標(biāo)題范文

[關(guān)鍵詞] 新疆紫草;過表達(dá)載體;RNAi載體;GATEWAY技術(shù)

[收稿日期] 2014-06-18

[基金項目] 國家自然科學(xué)基金項目（81130070，81072989）;國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] *郭蘭萍，Tel：（010）64011944，E-mail：

[作者簡介] 謝騰，碩士，Tel：18310830559，E-mail：

新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是藥用紫草的主要來源[1]，其重要成分紫草素類化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多種藥理活性[2-4]，同時也是天然的化工染料和食品添加劑[5-6]。

紫草素類化合物通常認(rèn)為是在限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、甲戊二羥酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）和對羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶（PGT）催化下，通過苯丙氨酸（phenylpropan-oid，PP）-甲羥戊酸（mevalonate，MVA）復(fù)合途徑合成。PAL是PP途徑中的起始代謝酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，進(jìn)而開啟對羥基苯甲酸（PHB）的合成。MVA途徑上的HMGR將甲戊二羥酸單酰輔酶A還原為甲戊二羥酸，進(jìn)而生成PP和MVA途徑的中間產(chǎn)物焦磷酸香葉酯（GPP）。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素類化合物前體香葉基-對羥基苯甲酸（GHB）[7-8]。

次生代謝通路上關(guān)鍵酶基因表達(dá)的變化會影響次生代謝物的生物合成，可以通過改變某特定基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)下游次生代謝，即基因的過表達(dá)（或超表達(dá)）和RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)，控制目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。為此，本研究擬構(gòu)建新疆紫草次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因PAL，HMGR，PGT過表達(dá)和RNA干擾載體，為培育新疆紫草次生代謝物高產(chǎn)株系和次生代謝相關(guān)基因的功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料

新疆紫草愈傷細(xì)胞取自中國科學(xué)院植物研究所葉和春研究員處。

基因過表達(dá)載體pH7WG2D和RNA干擾載體pK7GWIWG2D均由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心提供。

2 方法

2.1 目的基因序列的獲取和引物設(shè)計

在NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）下載目的基因序列：PAL（gi|90994675），HMGR（gi|91208650），PGT（gi|158957516）。

過表達(dá)載體的片段為目標(biāo)基因的全長，引物位于ORF外，RNA干擾的片段引物位于ORF內(nèi)。使用Primer Premier 5分別設(shè)計含CACC接頭和不加CACC接頭的合適引物。

2.2 新疆紫草cDNA的獲得

采用Trizol法新疆紫草愈傷組織細(xì)胞總RNA提取，并做RNA質(zhì)量檢測。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，將新疆紫草新鮮RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，并至于-20 ℃保存。

2.3 PCR擴(kuò)增

2.3.1 通用PCR擴(kuò)增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR擴(kuò)增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.3.2 菌液PCR擴(kuò)增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR擴(kuò)增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.3.3 高保真PCR擴(kuò)增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR擴(kuò)增，以T載體克隆所得質(zhì)粒為DNA模版，所用引物含CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.4 PCR產(chǎn)物的回收與純化

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與純化使用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。將所得到的DNA保存于-20 ℃。

2.5 PCR產(chǎn)物的T載體克隆

PCR產(chǎn)物的T載體克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴過夜，轉(zhuǎn)入DH5α，LB平板（氨芐霉素，Amp抗性）培養(yǎng)過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌

選擇Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，吸取200 μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素LB瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂開細(xì)胞，至液體被吸收，倒置平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。篩選菌落并菌液PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.7 質(zhì)粒提取

質(zhì)粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit試劑盒。

2.8 GATEWAY方法構(gòu)建載體

GATEWAY技術(shù)是基于λ噬菌點特異性的成熟重組體系，由BP，LR 2個反應(yīng)就構(gòu)成，可同時轉(zhuǎn)化多個基因，較其他載體構(gòu)建方法快捷高效[9]。BP反應(yīng)將目的基因從PCR產(chǎn)物重組到供體載體，從而形成入門載體（donor vector），LR反應(yīng)則將入門克隆重組入目的載體（destination vector）[10-11]。

2.8.1 BP連接反應(yīng) 使用Invitrogen公司pENTRTM SD/D-TOPO Vector做入門載體連接高保真PCR產(chǎn)物。在微量離心管中配制BP反應(yīng)混合液（3 μL體系）：1.5 μL ddH2O，0.5 μL 高保真PCR產(chǎn)物，0.5 μL salt solution，0.5 μL 入門載體。22 ℃水浴3 h，轉(zhuǎn)入DH5α，LB平板（卡那霉素，Kana抗性）培養(yǎng)過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.8.2 LR連接反應(yīng) 選擇BP反應(yīng)測序成功的質(zhì)粒，進(jìn)行LR反應(yīng)。使用Invitrogen公司LR Clonase Ⅱ enzyme mix介導(dǎo)目的基因從入門載體的連接到入門載體。過表達(dá)載體為pH7WG2D，RNA干擾載體為pK7GWIWG2D，在微量離心管中配制LR反應(yīng)混合液（4 μL體系）：1 μL 入門克?。?0～150 ng），1 μL 目的載體 （150 mg?L-1），1 μL LR Clonase Ⅱ enzyme mix，1 μL ddH2O。25 ℃水浴12 h，加入1 μL proteinase K solution，37 ℃水浴5 min，終止LR反應(yīng)。將LR連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α，LB平板（壯觀霉素，Spe抗性）培養(yǎng)過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

載體構(gòu)建的流程見圖1。

圖1 載體構(gòu)建流程圖

Fig.1 Flow chart of vector construction

3 結(jié)果

3.1 引物合成

依據(jù)NCBI提供的新疆紫草PAL，HMGR，PGT的cDNA序列，設(shè)計并合成目的基因過表達(dá)載體和RNA干擾載體構(gòu)建所需cDNA擴(kuò)增特異性引物，見表1。

3.2 T載體克隆

將已純化的過表達(dá)和RNAi基因PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector連接，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α進(jìn)行菌液培養(yǎng)，菌液PCR獲得目的基因的T載體質(zhì)粒，見圖2。

表1 PAL，HMGR，PGT擴(kuò)增特異性引物

Table 1 Primers of PAL， HMGR， PGT for overexpression （upper） and RNAi （lower）

引物名稱 序列（5′-3′）堿基數(shù)片段長度/bp

過表達(dá)載體PAL-FTGCTAATACTTCCACACG182 386

PAL-RGAGAACAAAAAGAAATAG18

HMGR-FTGAAACAATCATCACTTAC192 013

HMGR-RTTTATCAATGAGGTGGAC18

PGT-FTAAACATCCCAAACTAAAG191 203

PGT-RAACAAATTTTGATAATGC18

PAL-F-CACCCACCTGCTAATACTTCCACACG222 386

PAL-R-CACCCACCGAGAACAAAAAGAAATAG22

HMGR-F-CACCCACCTGAAACAATCATCACTTAC232 013

HMGR-R-CACCCACCTTTATCAATGAGGTGGAC22

PGT-F-CACCCACCTAAACATCCCAAACTAAAG231 203

PGT-R-CACCCACCAACAAATTTTGATAATGC22

RNA干擾載體PAL-FTGAGTCAATGAAGGGTAGC19490

PAL-RGAGGGGTAGGAATGGAGTAA20

HMGR-FCTCGGTTCCTATGGCTAC18525

HMGR-RCAGGAGCACATCGTCTTG18

PGT-FATTTGGATGGTGGGCAGTT19328

PGT-RTAAAGCGGGTAGGCGATA18

PAL-F-CACCCACCTGAGTCAATGAAGGGTAGC23490

PAL-R-CACCCACCGAGGGGTAGGAATGGAGTAA24

HMGR-F-CACCCACCCTCGGTTCCTATGGCTAC22525

HMGR-R-CACCCACCCAGGAGCACATCGTCTTG22

PGT-F-CACCCACCATTTGGATGGTGGGCAGTT23328

PGT-R-CACCCACCTAAAGCGGGTAGGCGATA22

1.PAL質(zhì)粒DNA;2.空載質(zhì)粒DNA;M.2 kb DNA Ladder（圖3～5同）。

圖2 過表達(dá)（上）和RNAi（下）基因的T載體克隆PCR凝膠電泳

Fig.2 T vectors cloned PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3 過表達(dá)和RNA干擾載體的構(gòu)建

3.3.1 高保真PCR 以構(gòu)建好的pGEM-T質(zhì)粒為模板，使用加有CACC的特異性引物，用高保真酶Phusion High-fidelity進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得過表達(dá)基因全長和RNA干擾基因片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，進(jìn)行下一步的BP反應(yīng)，見圖3。

圖3 過表達(dá)（上）和RNAi（下）基因高保真PCR凝膠電泳

Fig.3 High-fidelity PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.2 BP連接反應(yīng) 獲得目的片段后進(jìn)行BP反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，在Kan抗性的LB培養(yǎng)皿37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，做菌液PCR鑒定，見圖4。提取測序正確樣品的質(zhì)粒進(jìn)行的LR反應(yīng)。

圖4 過表達(dá)（上）和RNAi（下）基因BP反應(yīng)凝膠電泳

Fig.4 BP reactions PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.3 LR連接反應(yīng) BP反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)過LR反應(yīng)，分別將目的基因克隆到過表達(dá)載體pH7WG2D和干擾載體pK7GWIWG2D上，轉(zhuǎn)化DH5α，在Spe抗性的LB培養(yǎng)皿37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，做菌液PCR鑒定，見圖5。測序結(jié)果顯示與目的基因的序列一致，說明新疆紫草次生代謝關(guān)鍵基因PAL，HMGR，PGT的過表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建成功。

圖5 過表達(dá)（上）和RNAi（下）基因LR反應(yīng)凝膠電泳

Fig.5 LR reactions PCR gel electrophoresis of overexpression （upper） and RNAi （lower） gene

本研究從NCBI獲得新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因，使用Primer Premier 5分別設(shè)計了過表達(dá)和RNA干擾引物，和對應(yīng)含CACC接頭的引物，并以新疆紫草cDNA為模版PCR克隆得到過表達(dá)載體構(gòu)建所需的全長基因（長度依次為2 086，2 013，1 023 bp）和RNA干擾所需的基因片段（長度依次為490，525，328 bp）。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后連接在pGEM-T EasyVector后使用高保真酶Phusion High-fidelity做PCR，并將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入了GATEWAY載體構(gòu)建技術(shù)的BP反應(yīng)入門載體pENTRTM SD/D-TOPO Vector，在卡那霉素抗性篩選后將新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的全長轉(zhuǎn)入過表達(dá)載體pH7WG2D，并將目的基因的編碼區(qū)片段轉(zhuǎn)入RNA干擾載體pK7GWIWG2D，經(jīng)測序驗證基因無變異。

4 結(jié)論

本研究采用本實驗室研究較為成熟的pH7WG2D，pK7GWIWG2D載體，使用GATEWAY載體構(gòu)建技術(shù)分別成功構(gòu)建了新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因過表達(dá)和RNA干擾載體，對于新疆紫草基因功能驗證和遺傳轉(zhuǎn)化的平臺建立起到了關(guān)鍵作用。

植物的代謝無時無刻不受到基因的調(diào)控，次生代謝物發(fā)生變化，意味著指導(dǎo)其生物合成的代謝通路有所異動，這種異動往往是由于代謝通路上某一個或一類關(guān)鍵酶基因的表達(dá)發(fā)生了變化，所以可以人為改變某特定基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)下游次生代謝，進(jìn)而控制目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。而這種基因表達(dá)的改變，莫過于上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)量，基因的過表達(dá)技術(shù)對應(yīng)著前者，RNA干擾則與后者對應(yīng)。

目的基因與一個強(qiáng)啟動子連接后，在載體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入植物體，使得目的基因在整個生命過程中都有表達(dá)，即實現(xiàn)過表達(dá)，這對于基因功能的研究有重要意義[12-19]。例如，將新疆雪蓮查爾酮異構(gòu)酶基因在煙草中的過表達(dá)，會使得煙草大量積累黃酮類化合物，總黃酮量能達(dá)到對照組的6倍[20]?；虻倪^表達(dá)在對次生代謝進(jìn)行調(diào)控的同時會改變植物的抗性，對于新品種的選育和開發(fā)有重要意義[21-22]。例如，崔道雷等的研究表明，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子對煙草中過表達(dá)云南紅梨的PybHLH基因，會顯著提高煙草的耐鹽性[23]。

RNAi形成的機(jī)制在于雙鏈RNA被降解為21～25 bp的siRNA（small interference RNA）并與特異蛋白結(jié)合為siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體，該復(fù)合體通過堿基互補(bǔ)配對識別并降解與之高度保守的同源mRNA，從而達(dá)到基因缺失的目的[24-25]，反過來就是通過研究RNAi干擾后植物所呈現(xiàn)的功能或表型的改變可以判斷擾基因的功能。例如，在宋婕的研究中，SmPAL1基因干擾的株系中咖啡酸的含量明顯低于對照組，丹酚酸B的含量卻有所提高，同時研究還發(fā)現(xiàn)RNAi植株中木質(zhì)素的含量也會有所降低，由此可以認(rèn)為SmPAL1基因會促進(jìn)咖啡酸和木質(zhì)素的合成[26]。RNA干擾除了可以調(diào)控植物次生代謝和驗證基因功能外[27-33]，同樣可以用于抗性植物的培育[34]。

由于新疆紫草分布區(qū)域狹窄，新疆紫草野生種群處于瀕危狀態(tài)，屬于國家國家重點保護(hù)野生植物[35]。生物工程培養(yǎng)新疆紫草獲取次生代謝產(chǎn)物[36]是目前滿足日益龐大的紫草素類化合物的工業(yè)和社會需求的主要手段[37]，也是新疆紫草目前研究的熱點[7-8]。過表達(dá)和RNAi載體的構(gòu)建，是進(jìn)一步構(gòu)建過表達(dá)株系或RNA干擾株系的先決條件。搭建基于過表達(dá)和RNA干擾的遺傳研究平臺是新疆紫草次生代謝物生物合成研究的不可或缺的部分。

本研究通過GATEWAY技術(shù)成功構(gòu)建了新疆紫草次生代謝關(guān)鍵基因PAL，HMGR，PGT的過表達(dá)載體和RNAi載體，同時提供了一套系統(tǒng)的載體構(gòu)建方法，對于搭建新疆紫草功能基因挖掘和驗證的遺傳研究平臺，和PAL，HMGR，PGT過表達(dá)株系和RNAi株系的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)，也填補(bǔ)了新疆紫草在該領(lǐng)域研究的空白，并為中藥次生代謝機(jī)制的研究提供了豐富的理論支持。

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Overexpression and RNAi vectors built for key secondary metabolic

pathway genes PAL， HMGR， PGT of Arnebia euchroma

XIE Teng1，2， LIU Yu-zhong2， WANG Sheng2， LIU Tan2， KANG Li-ping2， GUO Lan-ping2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China;

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Arnebia euchroma is the main source for medicinal herb Zicao. and its most important component shikonin compounds have high medicinal and industrial value. This research is aimed to build overexpression vectors and RNAi vectors for key secondary metabolism genes of A. euchroma， and bulid platform for constructions of related transgenic lines using GATEWAY technology. To build genetic material based genetic research platform is to provide a great convenience for digging and functional verification of the genes on secondary metabolic pathway， and also to fill the gaps in transgenic research of A. euchroma. This study is also important for the cultivation of shikonin high-yielding strains of A. euchroma.