前言：一篇好文章的誕生，需要你不斷地搜集資料、整理思路，本站小編為你收集了豐富的膠質母細胞瘤主題范文，僅供參考，歡迎閱讀并收藏。
目的 觀測Smad7對腦膠質母細胞瘤U251細胞增殖及浸潤的影響。方法 應用CCK8和RTPCR分別檢測Smad7穩定轉染U251細胞與空載體轉染U251細胞及U251細胞在增殖和Ncadherin 、Ecadherin、 vimentin、 twist基因表達的差異。結果 Smad7轉染后，上皮細胞間質化相關基因表達未見改變(P＞0.05)，但相對于空載體轉染U251細胞及U251細胞其增殖速度減慢。結論 Smad7穩定轉染后未見膠質母細胞瘤上皮細胞間質化改變，但Smad7高表達可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖。
膠質母細胞瘤（GBA）是最為惡性的顱內腫瘤之一，由于缺乏有效的臨床治療手段，GBA的預后極差。大量的研究數據表明，轉化生長因子β（TGFβ）1在GBA惡性演進過程中發揮著至關重要的作用〔1～3〕。TGFβ異常所致疾病，通常是由于它的信號通路調控異常所引起的。Smad7蛋白作為TGFβ的細胞內重要負反饋調節因子，在腫瘤分子治療方面的作用日益受到重視〔4～6〕。然而，Smad7在腫瘤惡性演進過程中所發揮的生物學作用卻存在著爭議，在一些腫瘤中，Smad7抑制腫瘤的生長與增殖，發揮著抑瘤因子的作用〔7，8〕，但在另外一些腫瘤中，Smad7的高表達水平卻與該腫瘤的發生密切相關〔5〕。所以現多認為，Smad7生物學作用是細胞依賴性的，而目前，關于Smad7對膠質瘤細胞生物學行為影響的研究少有報道。
本實驗以穩定轉染了Smad7的GBA細胞系U251細胞（SU2）、轉染了空載質粒PcDNA3.0的U251細胞（CU）及正常U251細胞為研究模型，比較SU2細胞與CU及U251細胞生物學行為的不同，探討Smad7對GBA細胞生物學行為的影響。
1 材料與方法
1.1 質粒和細胞株
人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞為本實驗室所保存。試劑：IMEM培養基 (Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)；G418 (Invitrogen)；RTPCR試劑盒（TaKaRa）;CCK8試劑盒（碧云天）。人膠質母細胞瘤U251細胞(U251組)、Smad7穩定轉染GBA U251細胞(SU2組)及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞(CU組)由本實驗室凍存；細胞復蘇用含10%胎牛血清IMEM培養，置于含5%CO2的培養箱中，在37℃、95%濕度條件下培養。
1.2 細胞總RNA抽提
分別復蘇人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞，以1?05/ml的接種密度將其分別接種入3塊六孔板中，待細胞長滿后，每3孔為1組，每孔中分別加入100 μl Trizol(Invitrogen)裂解，按照試劑盒說明書抽提RNA，分光光度計測定濃度。所有樣品RNA 260/280 OD比值均為1.8～2.0。
1.3 RTPCR
逆轉錄cDNA：反應總體系30 μl，取標本總RNA1.5 μg，加入RT反應液中（TaKaRa）。反應條件為：30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR：反應總體系50 μl，取RT反應產物10 μl加入PCR反應液（TaKaRa）40 μl中，各引物序列見表1。反應條件：94℃ 2 min，94℃變性15 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環。最后72℃ 5 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠，80 V電壓電泳45 min，PCR產物條帶密度應用凝膠成像系統掃描，并應用Kodak Digital Science 1D軟件進行定量，每組實驗均重復3次。表1 引物序列（略）
1.4 細胞劃痕實驗
以1?05/ml的接種密度將人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞分別接種入3塊六孔板中，待細胞長滿后，移除細胞培養基，經PBS清洗后，加入不含血清的IMEM培養基，用200 μl黃色槍頭在各個孔中垂直劃痕，24 h后，顯微鏡下觀察細胞遷移情況。
1.5 CCK8計數細胞
將人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞分別接種入96孔板內，每種細胞接種于3個孔內，細胞密度為0.5?04/孔，置于37℃，5% CO2飽和濕度培養箱內培養24 h后，取出1個96孔板，在各孔內加入10 μl的CCK8試劑，前后搖勻；將培養板放在培養箱內孵育2 h后450 nm波長處測定吸光度，將各實驗組OD值減去無細胞組及空白孔OD值，每隔24 h重復上述實驗步驟，共重復6次。
1.6 統計學處理
計量數據以x眘表示，采用SPSS14.0軟件進行組間t檢驗。
2 結果
2.1 Ncadherin 、Ecadherin、 vimentin、 twist等基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測
紫外光下觀察見Ncadherin 、Ecadherin、 vimentin、 twist等靶基因均為單一條帶，且大小與目的片段大小相符。然而，上述基因在人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞的表達未見有明顯差異(P＞0.05)，見圖1。為了觀察Smad7轉染后對GBA 生長的影響，應用CCK8試劑盒測定細胞數目，并制定生長曲線，發現轉染了Smad7的GBA 細胞生長速度較U251細胞及空載轉染細胞明顯低(P＜0.05)。見圖2。
2.2 腫瘤細胞的培養及劃痕實驗
人GBA U251細胞、Smad7穩定轉染GBA 細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞經培養后，未見明顯形態差異，均呈貼壁生長，胞體較大，呈多形性，有多個突起，培養2 d后，當細胞密度增加后，胞體呈成纖維樣改變。同時，三種細胞劃痕實驗結果未見顯著性區別(P＞0.05)。
3 討 論
Smads是TGFβ的重要細胞內調節因子，通常將其分為3種類型受體調節型：包括Smad2和Smad3，其最先由TGFβ1型受體激活；協同調節型：即Smad4；抑制型：包括Smad6和Smad7。當受體調節型Smad被激活后，與Smad4形成異聚體，進而從細胞質進入核內，發揮轉錄因子功能而激活靶基因。同時也激活抑制型Smad，形成反饋調節抑制。
TGFβ與惡性腫瘤的發生發展密切相關，但具體分子機制目前仍不清楚，現有研究認為，TGFβ主要是通過促進上皮細胞間質化（EMT）的過程來促進腫瘤的侵襲及轉移。EMT 主要是指已分化的上皮細胞向間質成纖維樣細胞過渡的一種過程，在EMT過程中，上皮細胞失去上皮細胞標記，如：Ecadherin。而一些間質化細胞的標記，如：Ncadherin、 vimentin、 twist等卻得以表達。作為TGFβ的主要細胞內抑制因子，Smad7對于EMT的影響少有報道，本研究發現Smad7穩定轉染U251細胞的形態與U251細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞的形態沒有明顯區別。同時在本研究中，還對Ecadherin 、Ncadherin、 vimentin、 twist等基因在上述幾種細胞的表達情況進行了分析，上述基因在這幾種細胞表達也未見明顯異常。這至少說明了Smad7對于GBA 的EMT的影響不大。
本實驗還發現Smad7穩定轉染U251細胞的生長速度明顯較U251細胞及空載質粒PcDNA3.0穩定轉染U251細胞低，通常認為，TGFβ具有抑制細胞生長的作用，Smad7作為TGFβ的重要抑制因子，其高表達應該促進細胞增殖，但本實驗結果卻不支持該理論。最近的研究發現，Smad7尚可不依賴于TGFβ而獨立發揮生物學功能，且與腫瘤細胞凋亡的發生密切相關〔7，9〕。推測很有可能Smad7也參與了膠質瘤細胞的凋亡過程，如果這個推論成立的話，那么Smad7對于GBA 的基因治療將具有重要意義。
【參考文獻】
1 Naumann U，Maass P，Gleske AK，et al. Glioma gene therapy with soluble transforming growth factorbeta receptors Ⅱ and Ⅲ〔J〕.Int J Oncol，2008；33：75965.
【關鍵詞】 多中心膠質瘤;膠質母細胞瘤;診斷;治療
多中心膠質瘤指遠離的各自獨立的膠質瘤存在于不同腦葉或半球，其間無既定途徑相連(如胼胝體，穹窿，內囊等)，排除經腦脊液循環播散的原發腦腫瘤或轉移瘤[1]。本科于2009年10月收治1例經病理切片證實的多中心膠質母細胞瘤。結合文獻對其組織起源、發病機理、診斷、治療及預后探討如下。
1 病 例
患者，男，44歲。因“頭痛20余天加重1周伴惡心嘔吐”入院。查體：神清，語利，四肢活動正常。視野檢查雙顳外上象限視野缺損。頭顱mri平掃：雙側枕葉及左側顳葉海馬區示散在長t1(圖1)長t2(圖2)信號，其周可見大片水腫樣信號，雙側腦室后角受壓。增強掃描可見2枚明顯環化強化灶(圖3)。入院診斷：顱內多發占位，考慮轉移瘤可能性大。就其原發病灶進行相關檢查尋找：腹部b超(肝膽脾胰雙腎)，甲狀腺及前列腺b超未見異常，相關腫瘤標記檢查結果均陰性。入院完善相關檢查后在全麻下行右枕葉開顱腫瘤切除術。術中見腦組織張力極高，腦膨出明顯，于矢狀竇與橫竇交匯處皮層造瘺約1cm見腫瘤組織，血供豐富，暗紅色，魚肉狀，腫瘤中心部分壞死囊變，包膜不完整，與周圍分界欠清，大小約3cm×3cm×4cm，切除腫瘤及部分水腫外膨腦組織，并去骨瓣減壓。病理報告為膠質母細胞瘤(who iv)gfap(+)(見第92頁彩色圖版ⅷ之圖4)、vimentin(+)(見第92頁彩色圖版ⅷ之圖5)。術后患者頭痛嘔吐等癥狀緩解，遺有雙顳外上象限視野缺損，術后2周接受放化療。
頭顱mri平掃：雙側枕葉及左側顳葉海馬區示散在長t1(圖1)長t2(圖2)信號，
其周可見大片水腫樣信號。增強掃描可見2枚明顯環化強化灶(圖3)。
2 討 論
2.1 組織起源與發病機理 多發顱內占位，常常考慮為轉移瘤，但原發性膠質瘤也可有類似表現[1]。多中心膠質瘤非常罕見，由于臨床表現，影像學及病檢多樣性不同，其發生率據報道約1%～10%[1,2]。brandley[1,3]于1880年第1次報道了多發膠質瘤病例，1963年batzdorf和malamud將其分為多局灶和多中心膠質瘤[4]，以區別于其他顱內腫瘤。與多中心膠質瘤不同，多局灶膠質瘤通過既定通路蔓延生長，或腦脊液血液循環播散，在局灶形成衛星結節樣改變[1]。膠質母細胞瘤(who iv)是其常見的惡性腫瘤之一，本例通過病檢證實;其次，星形細胞瘤，室管膜細胞瘤等亦有相關報道。有報道多中心膠質母細胞瘤占其膠質母細胞瘤的2.4%～4.9%[5]。kyritsis等，對51例多發性膠質瘤病理切片觀察，其中有31例病檢為膠質母細胞瘤，且多中心膠質瘤各瘤結節可為相同類型或不同類型組成[6]。
多中心膠質瘤發病機理尚不明確，有多種假說，但或多或少都存在質疑。有學者認為源于膠質母細胞在最初發育時突變散播在中樞神經系統中形成，或者身體其他器官的癌細胞突破血腦屏障，種植在大腦中，其具體入腦途徑及發病機理尚不清楚。willis提出“兩階段”假說：首先，腫瘤突變過程發生在整個大腦或其廣泛領域，其中一些對其有抵抗性，而另一些則有傾向性，適于腫瘤生長;其次，在其發育過程中，腫瘤可能源于同種或非同種原始細胞，在不同因素(生化，激素，病毒，寄生蟲等)刺激下進而形成[1,2,7,8]。迄今尚無確實滿意學說解釋其發病機理。
2.2 臨床表現與診斷 多中心膠質瘤發病年齡廣泛，但多發生于中老年人，兒童亦有相關報道[2,7,8]。其臨床表現多樣而無特征性，多取決于腫瘤侵犯部位和速度，臨床表現有局灶神經系統癥狀，如感覺運動障礙、視野缺損、失語，以及癲癇和顱內高壓癥狀等[2]，本例表現為顱內高壓及視野缺損。頭顱mri及ct為診斷提供了不可或缺的輔助工具，但與ct相比，mri及增強對明確其腫瘤數量、性質、侵犯邊界及水腫延伸帶更有優勢。多中心膠質瘤主要應與顱內多發轉移瘤、腦膿腫相鑒別，轉移瘤常有原發病灶存在，且轉移瘤多位于頂枕葉皮質層或白質交界，而多中心膠質瘤則位置不定，轉移瘤多不規則環形強化，而多發膠質瘤在增強可表現單一增強或環形強化，轉移瘤邊界呈多樣性，而多中心膠質瘤邊界多不清楚。膿腫壞死多伴有周身病菌原發灶感染及腦脊液炎性改變，另外，dwi擴散加權常用來鑒別腫瘤壞死(低信號)和膿腫壞死(高信號)。總之，其鑒別診斷在ct、mri上區分仍存在困難[2]，易誤診，本例最初即誤診為多發轉移瘤，確診金標準仍是病理活檢。多數學者認為立體定位穿刺活檢對明確診斷是非常安全可靠的，國外有報道致殘率和死亡率均0%[1]。
近來，新技術fdgpet可以觀察其腫瘤生物特性及分化代謝之優勢，特別是針對顱內多發腫瘤的不同代謝方式，并對其臨床、生物形態學及分子生化特性具有潛在的預見能力[5]。多中心膠質瘤的真實發生率很可能與現實報道不符，特別是與九十年代前比較，其主要原因在于神經系統影像學如mri發展及普及應用。另外，不同學者依據其發病機理、生長部位、產生時間先后、病理特點分級及預后好壞等側重點不同，使得多中心或多局灶膠質瘤的診斷和分類標準亦存在多樣性[2,9]。
2.3 治療與預后 多中心膠質母細胞瘤預后多不佳，不少國外學者認為其確診比積極手術治療對其延長患者生命更有意義[1,2,7]。在治療方面的選擇仍存在爭議：以往多拒絕手術，選擇“姑息治療”，主要原因在于手術過多切除腦組織及大量出血可能危及患者生命和出現神經功能受損影響其生活質量[7]。目前觀點認為應早期診斷，盡可能多地切除腫瘤，且通過立體定向顯微外科入路避免損傷功能區和防止過多出血，輔以放化療[10]。而國內更傾向于以手術治療為主，但膠質母細胞瘤不太可能做到真正完全切除，應盡量做到多切除腫瘤同時作內外減壓術[11]。總之，多中心膠質瘤以中老年多見，發病機理不詳，其臨床表現多樣，可依據影像學檢查并借助立體定向穿刺活檢提高確診率，選擇適宜手術結合放化療的治療方案，以延長患者生存時間和提高生活質量[1]。
【參考文獻】
1]maurizio s, emanuela c, epimenio ro,et al.multicentric gliomas: our experience in 25 patients and critical review of the literature[j]. neurosurg rev, 2003, 26:275279.
[2]zhaohui li, yu tian, guozhang hu, et al.multiple gliomas[j].chinese journal of clinical oncology, 2007,6(4):379383.
[3]bradley wl. case of gliosarcomatous tumors of the brain[j]. proc conn med soc, 1880, 2: 3941.
[4]batzdorf u, malumid n. the problem of multicentric gliomas[j]. j neurosurg, 1963, 20: 122136.
[5]cecile c, eric g, philippe m, et al.fdgpet to predict different patterns of progression in multicentric glioblastomas: a case report[j]. j neurooncol, 2008, 90: 4751.
[6]kyritsis ap, levin va, yung wk, et al.imaging patterns of multifocal gliomas[j]. eur j radiol, 1993, 16: 163170.
[7]zamponi z,rychlicki f,ducati a, et al.multicentric glioma with unusual clinical presentation[j]. child's nerv syst, 2001, 17: 101105.
[8]j francisco, marcos v,andre r, et al.positive reactiion for cysticercosis and multicentric anaplastic oligoastrocytoma[j]. childs nerv syst, 2006, 22: 182185.
【關鍵詞】 腦腫瘤，膠質瘤；體層攝 影術，X線計算機
CT圖像上表現為均勻高密度的腦星形膠質細胞瘤不多見，國內文獻只有零星報道，較少有系統介紹[1]。本文收集1997年3月-2008年12月間經手術病理或臨床、影像追蹤證實的27例，主要就其CT表現介紹如下。
材料與方法
1.一般資料
本組27例，男8例，女19例。年齡30-70歲，以頭部外傷檢查者7例，以突發癲癇來檢查者9例，以頭痛伴肢體無力來檢查者11例，病程最短1天，最長3個月。
2.檢查方法
使用philips Brilliance 6全身螺旋CT機或島津SCT-4500TF全身CT機。使用島津SCT-4500TF全身CT機掃描12例。常規10mm層厚/層距，部分5mm層厚/層距。其中2例行增強掃描，用60%泛影葡胺50ml靜脈手推后掃描。使用philips Brilliance 6全身螺旋CT機掃描15例，9例直接軸掃，6例螺掃后重建。其中3例行增強掃描，50ml碘海醇高壓注射器注入靜脈后螺旋掃描。
結果
1．CT表現
本組幕上多見，共23例，幕下4例。幕上者分別位于額葉、頂葉、枕葉各7例，基底節3例，位于大腦白質區20例，灰質區10例。病灶邊緣不清楚者24例，清楚者3例。病灶最大者2.8cm×3.2cm，最小者1.0cm×1.0cm。病灶周邊均無水腫。12例行增強掃描，4例無強化，8例輕度至中度均勻強化。
2.手術病理
19例于一周內手術，2例經定向穿刺活檢。病檢結果：間變性星形細胞瘤7例，巨細胞性膠質母細胞瘤7例，毛細胞性星形細胞瘤3例，多形性黃色星形細胞瘤4例。
3.病例舉例
患者，女，60歲，以突發癲癇來診。頭部CT平掃示：左額頂葉白質區見一大小約1.2cm×2.0cm稍高密度影，邊緣不清，質地均勻，CT值約47HU，周邊無水腫影，考慮灰質異位或者腦腫瘤（圖1）。臨床經脫水對癥治療，兩周后復查CT。平掃見左額葉病灶明顯擴大，邊緣不清，質地不均，局部密度增高（圖2）。手術見腫瘤呈紫紅色，質軟脆，血運豐富，邊界不清，無包膜，分塊切除腫瘤，鏡下全切。病理診斷：巨細胞性膠質母細胞瘤（WHO IV級）。
患者，女，60歲，頭痛一周，伴右下肢無力。頭部CT平掃示：左尾狀核頭部見一小結節影，呈稍高密度，CT值約67HU，邊緣尚清，外緣不整，增強掃描無強化（圖3，4）。選擇病變為靶點，穿刺搜集約5mmX5mmX10mm組織，見組織呈暗紫紅色，血運豐富，冷凍送檢。病理結果：間變性星形細胞瘤（WHO III級）。
討 論
腦膠質瘤起源于神經間質細胞即膠質細胞，為顱內最常見的腫瘤，占全部顱內腫瘤的40%。常見的有星形細胞瘤、少枝膠質瘤、室管膜瘤及髓母細胞瘤等，以前者最常見。該瘤可發生于任何年齡，但多發于青年人。成人好發于幕上，兒童好發于幕下。腫瘤無包膜，生長方式呈浸潤性。腫瘤易發生囊變、壞死、鈣化、出血等。其病理表現因細胞間變程度，腫瘤血管及退行性變而異。通常CT表現為腦內低密度腫塊，邊界不清，形態不規則，周圍腦質有水腫，有顯著占位效應。而Ⅰ、Ⅱ級星形細胞瘤呈浸潤性生長，但與膠質間境界清晰，周圍很少有水腫區。由于腫瘤血管內皮細胞結合緊密，血腦屏障較為良好，因而不發生或較少發生造影劑血管外溢，故無強化或僅有輕度強化[1，2]。
組織學上腦膠質瘤分4型，即纖維細胞型，原漿細胞型，毛發細胞型和肥胖細胞型，在CT和MRI上4型無明顯區別。CT及MRI將其分為四級，I級為良性，II級為過度性，III，IV級為惡性[2]。
文獻介紹，通過對照研究發現，毛發細胞型一般僅表現在I級，肥胖細胞型僅表現在II級以上者，以III，IV級為多，纖維細胞型和原漿細胞型表現在I-IV級中[2]。據統計，I級者13.3%為混合密度灶，III，IV級中13.1%為高低等密度灶，其中高密度灶為出血，II級中多數為混合密度灶[2]。本組病例所見與此不一，本組病理分級為III--IV級，但均為均勻高密度病灶。本組CT顯示的高密度灶病理中未發現出血灶，多為纖維細胞。
作者發現部分膠質瘤平掃時為片狀略高密度影，邊界清晰，周圍無水腫，中等強度強化，此類腫瘤易被誤診為腦血管畸型，海綿狀血管瘤。此類膠質瘤病理改變常為細胞間變程度低、浸潤性小、生長緩慢，多為Ⅰ、Ⅱ級星形細胞瘤[3]。本組CT表現與其相似，但病理分級均比較高，多為III-IV級。
本組病例在早期多數被誤診[1]，分別誤診為腦挫裂傷并血腫、高血壓腦出血、血管畸形、腦灰質異位、腦膜瘤等。所以，在日常工作中，遇到上述CT表現應想到高密度腦星形膠質細胞瘤可能。
參考文獻
1. 胡洪斌. 高密度腦膠質瘤CT誤診分析[J].中華誤診學雜志，2009，9（25）6212-6213.
【關鍵詞】 腦腫瘤 神經膠質瘤 腫瘤轉移 層粘連蛋白 免疫組織化學
ABSTRACT: Objective To explore expression patterns of laminin α1、α2、α3、α5 subunit in the human brain glioma. Methods The expression of laminin α1、α2、α3、α5 subunit in 77 brain glioma，8 normal brain tissue and 10 metastatic tumor specimens were analyzed by immunohistochemistry and image analysis technique. Results 1.There were negative expression of laminin α2、α3 subunit and positive expression of laminin α1、α5 subunit in the human brain gliomas， whose positive staining located in tumour cell membrane， plasma. The positive staining intensity was correlated with pathological grade of glioma（P0.05)， but was stronger than expression in metastatic tumor (P
KEY WORDS: brain neoplasms; glioma; neoplasm metastasis; laminin; immunohistochemistry
福建醫科大學學報 2008年7月 第42卷第4期梅文忠等：層黏連蛋白α1、α2、α3、α5亞基在人腦膠質瘤中的表達層黏連蛋白（laminin，LN）是一族具有多種生物學功能的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)糖蛋白，它們參與基底膜構建，對維持基底膜的完整結構起重要作用，還在細胞黏附、生長、遷移中扮演著至關重要的角色[1]。研究表明，某些LN分子在膠質瘤細胞中表達增高，且與腫瘤病理級別相關，參與膠質瘤侵襲性生長而罕見顱外轉移行為的調控[23]，但是以往的研究多是針對LN蛋白分子或某些LN亞型分子的研究，如LN5，LN8，LN9，LN10/11等。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測LNα1，α2，α3，α5亞基在不同病理級別的腦膠質瘤中的表達情況，探討其與人腦膠質瘤生物學行為的關系。
1 材料和方法
1.1 材料
手術切除并經病理檢查證實的人腦膠質瘤標本77例，其中星形細胞瘤41例、少突膠質細胞瘤7例、混合型膠質細胞瘤10例、室管膜瘤9例、髓母細胞瘤3例、膠質母細胞瘤7例。77例中，男性49例、女性28例，年齡（35±5.9）歲（3～70歲）。參照2000年WHO神經系統腫瘤分類及分級標準：Ⅰ級10例，Ⅱ級34例，Ⅲ級23例，Ⅳ級10例；術前均未接受放療或化療。取10例經病理檢查證實的非神經系統來源的腦內轉移瘤標本，男性7例，女性3例，年齡（54±2.8）歲（45～72歲）。8例正常腦組織標本取自顱腦損傷行內減壓術患者，男性5例、女性3例，年齡（37±4.3）歲（13～61歲）。所有組織標本取后立即用10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，研究時選取典型蠟塊作2～4 μm連續切片。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
羊抗人LNα1，α2，α3，α5亞基多克隆抗體(濃縮型)購自美國SantaCruz公司；超敏SP試劑盒購自福州Maixin Bio公司。
1.2.2 免疫組織化學
使用檸檬酸鹽（PH 6.0）高溫高壓修復法進行抗原修復，免疫組織化學使用超敏SP法，具體參照說明書進行。抗體工作濃度（1∶100）。
1.2.3 結果判斷
定位于腦膠質瘤細胞質及細胞膜上根據染色程度及染色細胞百分率進行分析評分[3]：著色缺如者為0分、淡者為1分、適中者為2分、深者為3分；著色細胞占細胞記數百分率＜5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、＞50%為3分；每張切片著色與著色百分率得分相乘為其最后得分：規定0～1分者為陰性（-）、2～3分者為弱陽性（+）、4～6分者為陽性（++）、>6分者為強陽性（+++）。
在腦膠質瘤血管內皮細胞膜及血管基膜染色陽性的指標，利用ImagePro Plus 6.0軟件測定陽性染色的血管內皮及基膜的平均光密度值（average optical density，AOD）和陽性染色的微血管管壁厚度（microvascular wall thickness，MWT）。
1.3 統計學處理
應用SPSS 11.5軟件對檢測數據進行統計處理，采用單因素方差分析、Kendall’s等級相關分析檢驗方法。P
2 結 果
2.1 LNα1，α5的表達
LNα1主要定位在腫瘤細胞膜上，病理級別越高染色越強；陽性染色的細胞呈巢狀分布或散在分布，在少數高級別膠質瘤標本中還可見陽性染色的瘤細胞圍繞著血管分布，而在血管內皮細胞及基膜無染色（表1～2，圖1）。表1 LNα1，LNα5在膠質瘤細胞中的陽性表達強度與病理級別的關系（略）表2 LNα5在血管內皮及基膜中的陽性表達強度與腦內腫瘤惡性程度的關系（略）
LNα5不僅在所有膠質瘤的瘤體及瘤周腫瘤細胞膜與細胞質上有染色，且病理級別越高染色越強；同時，血管內皮細胞及基膜也出現陽性染色，表現為靠管腔的一層內皮細胞和基膜呈連續、完整的陽性染色，但染色強度在膠質瘤各級別之間無明顯差異。然而，LNα5在正常腦組織的血管內皮細胞及基膜無陽性染色，在腦內轉移瘤的血管內皮細胞及基膜也僅見弱陽性染色，但染色基膜呈不連續，染色強度低于膠質瘤組；不過，膠質瘤和轉移瘤標本血管腔中紅細胞膜上均可見LNα5強陽性染色(圖1，2)。
2.2 LNα2、α3的表達情況 LNα2、α3亞基在膠質瘤細胞及血管內皮細胞和基膜中均無陽性表達。
3 討 論
研究發現，LN能增強膠質瘤細胞活動性，促進膠質瘤細胞粘附和遷移，促進腫瘤的侵襲[1，3]。陳菊祥等利用含13939種人類基因的BioStarH40S型芯片篩選人腦膠質母細胞瘤與侵襲性相關基因的表達和功能，結果發現層黏連蛋白、血小板衍化生長因子受體A（PDGFRA）等8條細胞骨架和細胞外基質基因均在膠質母細胞瘤中顯著上調[4]。研究也發現PDGFRA和LN可以促進腫瘤新生血管的形成，導致膠質母細胞瘤侵襲性增強[5]。最近，Kawataki等在體外實驗中發現含α3的LN5和含α5的LN10可強烈的促進膠質瘤細胞遷移，含α1的LN1作用較弱，含α2的LN2和α4的LN8在體外對膠質瘤細胞遷移無促進作用[6]。本研究發現，LNα1、α5在膠質瘤的瘤體及瘤周、瘤細胞質與細胞膜均有表達，表明LN可由瘤細胞合成、組裝、分泌；本研究發現LNα1、α5在膠質瘤細胞漿膜的表達強度與病理級別密切相關，隨著病理級別的增高而表達增強，提示它們可能與瘤細胞惡性程度有關，促進瘤細胞之間或瘤細胞與ECM、血管基膜之間的黏附和遷移。
臨床病理發現，腦組織雖是身體其他器官原發癌轉移的好發部位，但顱內原發腫瘤卻很少顱外轉移，其原因也被認為與LN在腦膠質瘤中的分布特征有關[3]。本研究發現，LNα5在膠質瘤血管內皮細胞和基膜上表達增高，且LNα5在基膜上的表達是連續的、完整的，與之前的文獻報道基本相符；而在腦內轉移瘤中見LNα5在血管內皮和基膜的表達較弱，且不連續、有斷裂。提示LNα5可能影響膠質瘤細胞侵襲血管向顱外轉移。
基膜上的LN除了可抑制瘤細胞穿越血管壁而發生轉移外，還可通過與瘤細胞表面存在LN受體（整合素類和非整合素類）的結合，誘導瘤細胞的黏附和遷移[7]。Lugassy等用內皮細胞形成類管腔結構并與腫瘤細胞共培養發現，膠質瘤細胞可沿著管腔外表面前行，并包繞在血管基底膜成分LN的外周[8]。提示本研究中的LNα5可能在影響膠質瘤顱外轉移的同時，還誘導膠質瘤細胞沿著血管基膜向正常腦組織遷移。此外，在臨床和不同動物實驗中也觀察到腦膠質瘤細胞還常沿有髓纖維（束內、束周及束間）侵襲，研究表明雖然腦膠質瘤細胞系能特異地粘附到中樞神經系統髓磷脂提取物，但比粘附到純化的LN上明顯要慢[9]。
呂德蘭血型糖蛋白（Lu），也稱為基底細胞黏附分子（BCAM），是表達于紅細胞膜上的一種LN受體，屬于免疫球蛋白超家族，研究表明它與LN的高親和力結合有助于器官發生、血管形成、紅細胞生成，研究還表明它在一些疾病和惡性腫瘤中高表達，并和其它的黏附受體一起涉及到腫瘤的惡性轉化和轉移[1011]。Kikkawa等研究發現在ECM蛋白中，僅僅含α5鏈的LN是Lu/BCAM的配體[12]。本研究發現LNα5除了在血管內皮細胞和基膜表達外，還在紅細胞膜上呈陽性染色，膠質瘤和轉移瘤標本中紅細胞膜上染色遠強于正常腦組織，膠質瘤與轉移瘤之間染色無明顯差異。提示高表達的LNα5結合到紅細胞膜受體上，其來源有可能是內皮細胞合成、分泌的，LNα5與Lu/BCAM相互作用在紅細胞運輸、腫瘤營養、血管內皮增生/新血管生成等過程中可能起重要作用。
不過，要確切地搞清楚是哪些LN亞基在腦膠質瘤的那些生物學行為中起作用？作用如何？分子機制何在？還需要借助現代分子生物學技術（基因敲除，基因轉染、RNAi干擾技術等）在體內外實驗（黏附、遷移、侵襲實驗）中進一步研究。
【參考文獻】
[1] Colognam H，Yurchenco P D. Form and funcation：the laminin family of heterotrimers[J]. Dev Uyn， 2000，218:213234.
[2] 江常震，陳錦鋒，何理盛，等. 層黏連蛋白，MMP2、MMP9及TIMP1在人腦原發性膠質瘤的表達及臨床意義[J]. 福建醫科大學學報， 2001，35(1):49.
[3] 林志雄，張鵬飛，江常震，等. 人腦膠質瘤中LN、FN及p53基因蛋白的免疫組織化學與其侵襲微生態系統的相關性探討[J]. 解剖學報， 2002，33(4):360365.
[4] 陳菊祥，盧亦成， 駱 純，等. 利用基因芯片研究與膠質母細胞瘤侵襲性相關的基因[J]. 中華神經醫學雜志， 2004，3(2):9395.
[5] Ljubimova J Y，Lakhter A J，Loksh A，et al. Overexpression of alpha4 chaincontaining laminins in human glial tumors identified by gene microarray analysis[J]. Cancer Research， 2001，61(14):56015610.
[6] Kawataki T，Yamane T，Naganuma H，et al. Laminin isoforms and their integrin receptors in glioma cell migration and invasiveness: evidence for a role of alpha5laminin(s) and alpha3beta1 integrin[J]. Exp Cell Res， 2007，313(18):38193831.
[7] Ruosatathi E. Control of cell motility and tumor invasion by extracellular matrix interactions Brit [J]. J Cancer， 1990，9:289292.
[8] Lugassy C，Haroun R I，Brem H，et al. Pericyticlike angiotropism of glioma and melanoma cells[J]. The American Journal of Dermatopathology， 2002，24(6):473478.
[9] Amberger V R，Paganetti P A，Seulberger H，et al. Characterization of a membranebound metalloendoprotease of rat C6 glioblastoma cells[J]. Cancer Research， 1994，54(15):40174025.
[10] Kikkawa Y，Miner J H. Review: Lutheran/BCAM: A Laminin receptor on red blood cells and in various tissues[J]. Connective Tissue Research， 2005，46:193199.
[關鍵詞] 膠質瘤；PI3K/AKT/mTOR；靶向治療；抑制劑
[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0165-04
膠質瘤是一種臨床上常見的顱內腫瘤，可占中樞神經系統原發性惡性腫瘤的80%。其中，中間變性膠質瘤以及膠質母細胞瘤往往伴隨著較低的治愈率及較高的死亡率[1]。臨床上，膠質瘤的治療主要是以外科手術結合放療、化療等措施為主，然而該類方案的治療效果仍不理想。隨著分子生物學的發展，針對影響膠質瘤增殖、轉移及遷移相關信號韉紀路的靶向治療成為一種新的治療模式并取得較好的療效[2]。其中，由于其促腫瘤作用，PI3K/AKT/mTOR信號通路分子靶向治療備受關注。接下來，本文著重對PI3K/AKT/mTOR信號通路在膠質瘤發生、發展中的作用及相關分子靶向治療藥物進行綜述。
1 PI3K/AKT/mTOR信號通路與膠質瘤
PI3K/AKT/mTOR信號通路主要由PI3K、AKT及mTOR三個關鍵因子組成。該通路的主要傳導機制如下：當PI3K受到受體酪氨酸激酶、Ras、整合素以及各種生長因子等多種因子作用而激活時，可通過磷酸化肌醇誘導3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇及3，4-二磷酸磷脂酰肌醇的生成[3]；接下來，激活的Akt可通過3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1及3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶2磷酸化，進而將信號傳遞給mTOR[4]；而兩種復合體形態的mTOR（雷帕霉素敏感mTORC1，對雷帕霉素不敏感mTORC2）可進而對下游相關mRNA的轉錄進行調節，最終影響細胞增殖、凋亡、分化、遷移等多種生理過程[5]。
近年來，PI3K/AKT/mTOR信號通路在腫瘤發生及發展中作用的研究多有報道[6]。在腫瘤細胞中，AKT可以通過磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化轉變為pAKT，而pAKT可進一步通過磷酸化激活caspase 9、Bad、FOXO、GSK-3b及IKK等因子促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。同時，pAKT還可以緩解TSC1/2和Rheb對mTOR的抑制，而激活的mTOR與RAPTOR結合后可以通過mTORC1磷酸化激活核糖體S6激酶，進而干預5’-TOP結構的mRNA翻譯，影響細胞的增殖。同時，pmTOR還可以與RICTOR結合并通過mTORC2磷酸化激活AKT，進一步促進細胞增殖。因此，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活表現出明顯的促腫瘤作用[7]。
至今為止，大量研究證實PI3K/AKT/mTOR信號通路可以促進膠質瘤的發生與發展。據報道，PI3K的陽性表達率與膠質瘤的分級、分期及KPS評分密切相關，還與膠質瘤較差的預后明顯相關[8，9]；AKT的表達與膠質瘤的惡性程度正相關，抑制AKT可以有效地抑制膠質瘤細胞的增殖及侵襲能力[10，11]；此外，mTOR對細胞周期有著明顯的調控作用，其高表達不僅會加速腫瘤細胞的增殖，還會抑制腫瘤細胞發生自噬，最終促進膠質瘤的發生與進展[12]。
2 PI3K /AKT/mTOR信號通路抑制劑
2.1 PI3K抑制劑
PI3K抑制劑最初主要以LY294002及渥曼青霉素為主。大量研究證實該兩種物質不僅具有明顯的抗瘤作用，還體現出對化療和放療敏感性的增強上。研究發現，LY294002可以通過促進p-AKT及Bcl-2的表達降低膠質瘤對替莫唑胺的耐藥性，并可以通過下調PI3K/AKT通路增加替莫唑胺對膠質瘤的細胞毒性，因而LY294002合并替莫唑胺可以有效地抑制膠質瘤細胞的增殖[13]。然而，由于其較短的半衰期，LY294002單獨使用往往不能有效地抑制膠質瘤細胞的生長[14]。同時，放療誘導的端粒酶活性上調可以逃避LY294002對PI3K的抑制，說明在膠質瘤放療時還需注意對端粒酶活性的抑制[15]。對于渥曼青霉素，研究證實該藥物可以通過抑制PI3K有效地阻礙膠質瘤的發展，并增強膠質瘤細胞對放療的敏感性[16]。然而，渥曼青霉素因毒副作用大、水溶性差及選擇性低等特征限制了其在臨床上的應用[17，18]。隨著分子生物學的發展，許多新型的PI3K抑制劑逐漸顯露并應用于膠質瘤的臨床研究中。作為渥曼青霉素的一種衍生物，PX-866可以明顯抑制膠質瘤細胞體外的侵襲力，而動物模型中的研究發現PX-866可以有效地抑制膠質瘤的生長并延長中位生存期[19]。BKM120是一種可以通過血腦屏障的PI3K抑制劑，表現出對腫瘤增殖抑制以及促進凋亡的作用。研究證實，BKM120可以劑量依賴性地抑制小鼠體內膠質瘤的生長，并提高生存期[20]；I期臨床試驗發現患者可以耐受BKM120聯合貝伐單抗的治療，該方案將進入Ⅱ期臨床試驗階段。此外，GDC-0032、BYL719及INK1117等一系列新型的PI3K抑制劑逐漸顯現，并有望成為高穩定性、低毒副作用的抗癌藥物。
2.2 AKT抑制劑
哌立福新和MK-2206是最常用的AKT抑制劑，均已進入Ⅱ期臨床試驗階段。在細胞中，哌立福新可以有效地通過阻礙AKT在細胞膜上的易位抑制AKT磷酸化。研究發現，哌立福新聯合mTOR抑制劑西羅莫司（CCI-779）可以有效地抑制小鼠體內膠質瘤的生長，并誘導凋亡；哌立福新聯合替莫唑胺表現出較強的抗腫瘤活性，但未能提高膠質瘤細胞對放療的敏感性。然而，較大的分子量使哌立福新不易通過血腦屏障，且其使用時往往伴有嚴重的胃腸道反應，因而限制了其臨床應用[20]。同樣作為AKT抑制劑，MK-2206表現出較好的抗腫瘤作用。據報道，MK-2206可以誘導膠質瘤LN-229和T98G細胞株自噬；MK-2206聯合吉非替尼可以促進小鼠體內膠質瘤的自噬與凋亡。鑒于AKT在PI3K/AKT/mTOR信號通路中既可以接受上游信號，也可以調控下游底物，AKT抑制劑在應用時建議與其他抑制劑聯合使用，以發揮更理想的抗腫瘤效果。
2.3 mTOR抑制劑
至今為止，大量的研究證實mTOR與腫瘤的增殖、凋亡以及耐藥性密切相關，因而mTOR抑制劑成為腫瘤靶向治療的熱點之一。鑒于PTEN缺失膠質瘤對mTOR抑制劑更為敏感，mTOR抑制劑在PTEN高頻率異常的情況下表現出更好的前景[6]。根據mTOR的兩種形態，研究較多的mTOR抑制劑主要包括mTORC1和mTORC1/2抑制劑。目前，研究較多的mTORC1抑制劑主要為雷帕霉素及相關類似物（如西羅莫司、依維莫司及AP23573等）。臨床上，雷帕霉素是移植時常用的免疫抑制劑，而依維莫司及西羅莫司多用于抗腫瘤的治療并已進入臨床試驗階段。據報道，雷帕霉素可以有效地阻滯細胞周期于G1期，抑制星形細胞膠質瘤的增殖，并誘導其凋亡及自噬；西羅莫司可以有效地抑制對雷帕霉素耐藥膠質瘤細胞的生長；依維莫司在膠質瘤細胞和動物模型中均表現出了較好的抗腫瘤作用。雖然大量研究表明這些藥物在臨床治療中表現出較好的耐受性，但單一藥物的干預往往無法有效地治療惡性膠質瘤。研究證實，西羅莫司單一治療復發性膠質母細胞瘤表現出較低的無進展生存期及中位生存期[21]；相比單用西羅莫司，西羅莫司聯合細胞毒藥物在膠質瘤的治療中表現出更好的效果；依維莫司聯合替莫唑胺及放療治療多形性膠質母細胞瘤患者表現出較好的耐受性以及較長的中位生存期；依維莫司聯合替莫唑胺、貝伐單抗及放療治療惡性膠質瘤的有效率可達61%。然而，還有報道稱雖然西羅莫司聯合放可以明顯提高膠質瘤小鼠的生存期，但由于對免疫系統的抑制，該方案會提高膠質母細胞瘤患者感染的風險；西羅莫司聯合索拉非尼治療膠質瘤表現出血小板減少的副作用。此外，一些交叉信號轉導通路及反饋回路的干擾也限制了這些藥物的臨床應用。另一方面，mTORC1/2雙重抑制劑主要為一些小分子的ATP競爭抑制劑，如Ku0063794、pp242、AZD8055、AZD2014及Torin等。除對mTORC1的抑制，mTORC1/2抑制劑還可以通過干預AKT磷酸化抑制mTORC2。據報道，Ku0063794可以通過抑制AKT磷酸化誘導膠質瘤自噬[22]；pp242可以誘導膠質母細胞瘤發生自噬；I期臨床試驗表明AZD8055可以通過阻滯細胞周期于G1期抑制腫瘤細胞的增殖；小鼠體內模型實驗發現AZD2014可以增強膠質母細胞瘤對放療的敏感性，進而延長生存期。
3 PI3K/mTOR 雙重抑制劑
鑒于mTOR相關抑制劑臨床活性的限制主要歸結于mTOR-p70S6K-PI3K反饋回路，因而同時作用于PI3K及mTOR抑制劑的開發展現出更為遠大的前景。通過大量的研究，人們發現許多PI3K/mTOR雙重抑制劑，并表現出較好的抗腫瘤作用，其中包括PI-103、SF-1126、NVP-BEZ235及XL765等。研究發現，PI-103對體內及體外膠質瘤模型均表現出較好的抑制效果；低濃度的PI-103可以通過阻滯細胞周期于G0-G1期有效地抑制膠質瘤細胞的增殖[23]；PI-103可以有效地抑制膠質瘤在體內模型中的生長，并未表現對細胞的明顯毒性。同時，SF-1126能夠明顯抑制動物模型中膠質瘤細胞株U87MG的生長[24]；XL765 能夠明顯減少腫瘤細胞的生長活性，與替莫唑胺聯合后表現出出色的抗瘤能力[25]。再者，體內及體外試驗均說明NVP-BEZ235可以增強膠質瘤對放療的敏感性，促進自噬，下調內皮生長因子的表達，防止血管生成，進而延長患瘤動物的生存期。此外，通過對細胞膜上PIP3形成的抑制，XL765能夠阻礙腫瘤細胞中AKT、p70S6K和S6的磷酸化，最終抑制腫瘤生長；與替莫唑胺相比，XL765干預后異種移植模型表現出更長的生存期。雖然這些抑制劑表現出較好的抗腫瘤作用，其應用仍需要進一步臨床試驗的證實。
4 小結
近年來，隨著抑瘤靶點的不斷發現，分子靶向治療得到飛速的發展。作為腫瘤發生與發展重要的信號傳導通路，特異性的PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑成為膠質瘤治療的新方案。然而，PI3K/AKT/mTOR通路靶向抑制劑在臨床應用時同樣存在藥物耐受、毒副作用及個體差異等問題。因此，在保證該通路抑制劑臨床抗瘤療效的前提下，避免不良反應的發生成為未來研究的主要發展方向。同時，個性化的靶向藥物之間以及與傳統治療手段的聯合應用成為有效增加抗腫瘤效果、降低不良反應的重要手段。隨著基因靶向治療的發展，腦膠質瘤臨床治療方向將有望產生更大的突破。
[參考文獻]
[1] Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[M].WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. Distributed by WHO Press，World Health Organization，2007：97-109.
[2] 米中波，焦保華. 腦膠質瘤分子靶向治療的研究進展[J]. 河北醫藥，2010，32（17）： 2422-2424.
[3] Riehle RD，Cornea S，Degterev A. Role of phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate in cell signaling[J]. Advances in Experimental Medicine & Biology，2013，991（3）：105-139.
[4] Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，et al. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex[J].Science，2005，307（5712）：1098-1101.
[5] 釓粲睿 張建生. mTOR抑制劑治療膠質瘤的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2009，36（6）：548-551.
[6] Omuro AM，Faivre S，Raymond E. Lessons learned in the development of targeted therapy for malignant gliomas[J]. Molecular Cancer Therapeutics，2007，6（7）：1909-1919.
[7] 梁若飛，劉艷輝. PI3K/Akt/mTOR信號通路靶向治療膠質細胞瘤研究進展[J]. 中華神經外科疾病研究雜志，2013，12（4）：375-377.
[8] Chakravarti A，Zhai G，Suzuki Y，et al. The prognostic significance of phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in human gliomas[J]. Journal of Clinical Oncology，2004， 22（10）：1926-1933.
[9] 孫曉陽，丁漣沭，金孝東，等. PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路與人腦膠質瘤惡性進展及預后的相關研究[J]. 中華神經醫學雜志，2011，10（1）：24-28.
[10] 韓磊，張安玲，岳曉，等. RNA干擾聯合抑制PI3KP85和AKT1表達對U251膠質瘤細胞侵襲的影響[J]. 中華神經醫學雜志，2010，9（6）：566-570.
[11] 金日華. Notch及AKT信號通路在腦膠質瘤細胞增殖及侵襲活動中的相互作用[D]. 吉林大學，2012.
[12] Eng CH，Abraham RT. The autophagy conundrum in cancer：Influence of tumorigenic metabolic reprogramming[J]. Oncogene，2011，30（47）：4687-4696.
[13] Chen L，Han L，Shi Z，et al. LY294002 enhances cytotoxicity of temozolomide in glioma by down-regulation of the PI3K/Akt pathway[J]. Molecular Medicine Reports，2012，5（5）：575-579.
[14] Hu L，Zaloudek C，Mills GB，et al.In vivo and in vitro ovarian carcinoma growth inhibition by a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor（LY294002）[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2000，6（3）：880-886.
[15] Millet P，Granotier C，Etuenne O，et al. Radiation-induced upregulation of telomerase activity escapes PI3-kinase inhibition in two malignant glioma cell lines[J]. International Journal of Oncology，2013，43（2）：375-382.
[16] Kubota N，Okada S，Inada T，et al. Wortmannin sensitizes human glioblastoma cell lines carrying mutant and wild type TP53 gene to radiation[J]. Cancer Letters，2000，161（2）：141-147.
[17] Lopiccolo J，Blumenthal GM，Bernstein WB，et al. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway：Effective combinations and clinical considerations[J]. Drug Resistance Updates Reviews & Commentaries in Antimicrobial & Anticancer Chemotherapy，2008，11（1-2）：32-50.
[18] Powis G，Bonjouklian R，Berggren MM，et al.Wortmannin，a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase[J]. Cancer Research，1994，54（9）：2419-2423.
[19] Koul D，Shen R，Kim Y W，et al. Cellular and in vivo activity of a novel PI3K inhibitor，PX-866，against human glioblastoma[J]. Neuro-Oncology，2010，12（6）：559-569.
[20] Koul D，Fu J，Shen R，et al. Antitumor activity of NVP-BKM120-A selective pan Class I PI3 Kinase inhibitor showed differential forms of cell death based on p53 status of glioma cells[J]. Clinical Cancer Research，2011，18（1）：184-195.
[21] Galanis E，Buckner J C，Maurer M J，et al. Phase II trial of temsirolimus（CCI-779） in recurrent glioblastoma multiforme：A north central cancer treatment group study[J].Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology，2005，23（23）：5294-5304.
[22] Fan QW，Weiss WA.Inhibition of PI3K-Akt-mTOR signaling in glioblastoma by mTORC1/2 inhibitors[J]. Methods in Molecular Biology，2012，821（821）：349-359.
[23] Bagcionder T，Wakimoto H，Anderegg M，et al. A dual PI3K/mTOR inhibitor，PI-103， cooperates with stem cell-delivered TRAIL in experimental glioma models[J].Cancer Research，2011，71（1）：154-163.
[24] Garlich JR，De P，Dey N，et al. A vascular targeted pan phosphoinositide 3-Kinase inhibitor prodrug，SF1126，with antitumor and antiangiogenic activity[J]. Cancer Research，2008， 68（1）：206-215.
【摘要】 目的 探討細胞粘附分子CD44、細胞增值核抗原Ki67在侵襲性垂體腺瘤中的表達及意義并探討二者之間的關系。方法 用免疫組化法檢測CD44s、CD44v5、Ki67在20例侵襲性垂體腺瘤和18例非侵襲性垂體腺瘤中的表達。結果 CD44s 和Ki67在侵襲性垂體腺瘤組中表達高于非侵襲性垂體腺瘤組(P0.05)。結論 CD44s和Ki67與垂體腺瘤的侵襲性生長行為有關，二者協同作用，在侵襲性垂體腺瘤的發生、發展中起重要作用，可作為侵襲性垂體腺瘤診斷和判斷預后的重要生物學指標。
【關鍵詞】 侵襲性垂體腺瘤；非侵襲性垂體腺瘤；CD44s；CD44v5；Ki67
Expression and Relationship between CD44 and Ki67 in Invasive Pituitary Adenoma
Key words：Invasive pituitary adenoma；Noninvasive pituitary adenoma；CD44s；CD44v5；Ki67
CD44是一種細胞表面糖蛋白，參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質（ECM）之間的特異性粘附，在腫瘤細胞的侵襲性生長和轉移過程中發揮重要作用。Ki67是一種與細胞增殖相關的核抗原，是近年來研究較為廣泛的細胞增生的標記。細胞的增殖與腫瘤的發生、浸潤、種植與轉移過程相關，評價細胞的增殖狀態對研究腫瘤的生物學行為，判斷其危害性具有重要意義。
本文對侵襲性垂體腺瘤中CD44及Ki67的表達進行研究，以探討這兩種蛋白在侵襲性垂體腺瘤生長中的意義及二者之間的相關性。
1 材料與方法
1.1 材料 標本取自2001～2005年華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院神經外科手術切除并經病理學證實的垂體腺瘤標本38例。男21例，女17例。年齡23～71歲，平均年齡39歲。依據內分泌學檢查：非功能腺瘤23例，生長激素腺瘤9例，泌乳素腺瘤5例，ACTH腺瘤1例。所有標本均有完整臨床資料并依據Wilson改良Hardy分類系統分級分期標準分組［1］：侵襲性垂體腺瘤組20例，非侵襲性垂體腺瘤組18例。
1.2 試劑和方法
1.2.1 試劑來源 CD44s、CD44v5、Ki67單克隆抗體及即用型鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化酶（SP）免疫組化染色超敏試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物工程技術公司，均為工作液。
1.2.2 免疫組化染色 標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚連續切片，常規脫蠟和水化后，分別用過氧化氫酶和動物血清處理10min。與CD44s、CD44v5、Ki67單克隆抗體4℃過夜。二抗溫育20min，DAB顯色5min，蘇木素襯染，各步驟間均以PBS洗片。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照， HE染色作組織學參照。
1.2.3 結果判斷 CD44s、CD44v5陽性細胞均定位于細胞膜，表現為細胞膜呈黃色或棕黃色，部分細胞漿染色。每張切片均在×400顯微鏡下觀察，連續觀察5個高倍視野，各記數100個細胞取其平均值，以百分數表示，陽性細胞數>30%定為強陽性，10%～30%定為弱陽性，
1.2.4 統計學處理 采用卡方檢驗及Pearson相關檢驗，P
2 結果
2.1 CD44s、CD44v5在垂體腺瘤中的表達
侵襲性垂體腺瘤中，CD44s陽性細胞染色較深，陽性細胞數多且集中。而非侵襲性垂體腺瘤中陽性細胞染色淺，陽性細胞數少且分散，見圖1。CD44v5 在各組中陽性細胞數均較少，染色淺，見圖2。侵襲性垂體腺瘤組中CD44s陽性15例（75%），CD44v5陽性7例（35%）。非侵襲性垂體腺瘤組CD44s陽性5例（27.8%），CD44v5陽性4例（22.2%）。兩組之間CD44s蛋白表達具有顯著性差異（χ2=8.474，P0.05），見表1。
2.2 Ki67抗原在垂體腺瘤中的表達
Ki67抗原陽性細胞定位于細胞核，表現為細胞核呈黃色或棕黃色，見圖3。Ki67抗原在垂體腺瘤中的表達見表1，兩組之間具有顯著性差異（χ2=8.657，P
2.3 CD44s和Ki67在垂體腺瘤中表達的相關性
CD44s蛋白陽性表達的標本中，有17例Ki67陽性，CD44s蛋白陰性表達的標本中，有11例Ki67陰性，CD44s強陽性表達的標本中Ki67也多呈強陽性表達（9/11，81.8%），二者具有顯著正相關（r＝0.473，P
3 討論
垂體腺瘤是顱內常見的一種良性腫瘤，因部分腫瘤生長突破包膜，侵襲鄰近組織，有學者將這部分腫瘤稱為侵襲性垂體腺瘤，其危害性主要在于對周圍結構的侵蝕，手術不易全切，術后易復發。侵襲性垂體腺瘤主要根據臨床及手術中所見判斷，尚缺乏統一有效的診斷標準。本研究采用的是目前比較公認的Wilson改良Hardy分類系統分級分期標準，3級和4級是侵襲性垂體瘤［1］。
腫瘤侵襲性生長及轉移的過程中，腫瘤細胞首先需從腫瘤基團分離并與細胞外基質（ECM）粘附，在這一過程中，細胞粘附分子發揮著重要的作用［3］。CD44作為粘附分子家族中的一員，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間的粘附，是細胞外基質成分透明質酸鹽的主要受體。根據CD44蛋白外顯子表達方式的不同分為標準型CD44（CD44s）和變異型CD44（CD44v）兩種類型［4］，對于它們在腫瘤中所起作用有不同的觀點。熊正文等［5］檢測正常腦組織及顱內轉移瘤和膠質母細胞瘤中CD44s和CD44v6蛋白的表達，發現正常腦組織中CD44s和CD44v6均為陰性，而CD44s在腦膠質母細胞瘤和顱內轉移瘤中呈高表達，CD44v6只在顱內轉移瘤中表達，在腦膠質母細胞瘤中不表達。由此認為CD44s與腫瘤的侵襲行為有關，而CD44v6則與腫瘤的轉移相關。本試驗研究結果也表明，CD44s在侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤中的表達具有顯著性差異（P
腫瘤的侵襲性生長還與腫瘤細胞的增殖活性有關，生長快的腫瘤具有比較強的侵襲性。細胞增殖核抗原Ki67標記指數能準確、可靠的評價細胞的增殖活性，是一種較理想、獨立的生物標志物。Mastronardi等［6］研究垂體腺瘤中Ki67抗原的表達，認為在侵襲性垂體腺瘤中的Ki67標記指數明顯高于非侵襲性垂體腺瘤，并提出將Ki67標記指數3.5%作為區分侵襲性和非侵襲性垂體腺瘤的標準。Ekramullah等［7］也認為高增殖能力的垂體腺瘤侵襲力強。我們分析38例垂體腺瘤中Ki67抗原的表達，也得出同樣的結論：Ki67抗原在侵襲性垂體腺瘤中的表達明顯高于非侵襲性垂體腺瘤，且有顯著性差異，說明Ki67抗原標記可以反應垂體腺瘤的生長速度及侵襲性，可以作為垂體腺瘤診斷及判斷預后的有價值的標記物［8］。
腫瘤細胞粘附性和細胞增殖活性與腫瘤侵襲性生長之間是否具有協同作用，尚未見文獻報道。本試驗中，CD44s和Ki67陽性表達具有顯著正相關（r＝0.473，P
綜上所述，我們認為垂體腺瘤侵襲性生長與腫瘤細胞的粘附及增值活性密切相關。因此，降低腫瘤細胞的粘附及增值活性也可降低腫瘤的侵襲性。同時，聯合檢測Ki67和CD44s則對提高侵襲性垂體腺瘤診斷的準確性及判斷預后具有重要意義。
【參考文獻】
［1］ Thapar K， Laws ER Jr. Growth homonesecreting pituitary tumors: operative management［A］. In: Krisht AF， Tindall GT， ed.Pituitary disorders comprehensive management ［M］.Baltimore，Maryland， USA: Lippincott Williams & Wilkins.1999. 243258.
［2］ 熊文浩， 李善泉， 周文雄，等. 垂體腺瘤p16蛋白及Ki 67表達的研究［J］. 上海第二醫科大學學報，2001，21(3)：226228.
［3］ Nagano O， Saya H. Mechanism and biological significance of CD44 cleavage［J］. Cancer Sci， 2004，95(12):930935.
［4］ Alaniz L， Cabrera PV， Blanco G. Interaction of CD44 with different forms of hyaluronic acid. Its role in adhesion and migration of tumor cells［J］. Cell Commun Adhes， 2002， 9(3): 117130.
［5］ 熊正文，馮驥良，蘇紅，等. CD44s、CD44v6在顱內轉移瘤和膠質母細胞瘤中的表達研究［J］. 實用醫學雜志，2005，21（1）：2931.
［6］ Mastronardi L， Guiducci A， Spexa C，et al. Ki67 labelling index and invasiveness among anterior pituitary adenomas:analysis of 103 cases using the MI B1 monoclonal antibody［J］. J Gin Pathol， 1999，52(2): 107111.
關鍵詞： 惡性腦膠質瘤;ΔNp73;免疫組織化學;預后
p73基因是近年發現的新的腫瘤相關基因[1]，因其基因、蛋白結構及功能與p53 基因具有相似性,被認為是p53基因家族抑癌基因的新成員[2]。ΔNp73是p73基因最常見的表達產物之一，在多數腫瘤組織中呈現高表達，如神經母細胞瘤、乳腺癌等[34]，表現出癌基因的作用，被認為與腫瘤的發生發展有關。 ΔNp73和惡性腦膠質瘤有無關聯性，能否作為預測5年生存率的一項新指標，目前報道很少。
1 材料與方法
1.1 一般資料 我院1999—2003年收治的94例惡性腦膠質瘤患者，隨訪術后5年生存情況，由病理醫師按WHO標準重新復核分級，其中多形性膠質母細胞瘤Ⅳ級12例，退變型星形細胞瘤Ⅲ級44例，膠質瘤Ⅱ級27例。
1.2 主要試劑 ΔNp73購自美國Calbiochem公司，SP試劑盒(中國福州邁新公司)。
1.3 方法 采用免疫組織化學SP法，切片常規脫蠟, 梯度乙醇水化, 抗原修復, 雙氧水去除非特異染色10 min, 加入一抗, 4℃冰箱過夜。滴加生物素標記二抗,室溫孵育15 min。DAB顯色。蘇木素復染、脫色、封片、照相。陰性對照用PBS代替一抗。甲醛固定的石蠟組織塊,連續4 μm 切片后行HE染色。
1.4 結果判定 陽性判斷標準參照文獻報道[2],ΔNp73陽性細胞顆粒位于細胞漿，在顯微鏡下隨機選5個高倍視野(200×)，每個高倍視野隨機選100個細胞來計數陽性細胞,取其平均值。陽性細胞率<10%記為陰性,陽性細胞率10%～25%記為弱陽性(+)，>25%～50%記為陽性(++)，>50%記為強陽性(+++)。
1.5 統計學分析 運用SPSS 16.0統計軟件進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 ΔNp73在惡性腦膠質瘤組織中的表達與5年生存率之間的關系 見表1。表1 ΔNp73在惡性腦膠質瘤組織中的表達與5年生存率之間的關系注：χ2=5.246，P=0.035
2.2 ΔNp73在惡性腦膠質瘤組織中的表達與臨床病理分級的關系 見表2。表2 ΔNp73在惡性腦膠質瘤組織中的表達與臨床病理分級的關系注：χ2=2.361，P=0.394
2.3 ΔNp73在乳腺癌中表達與淋巴結轉移之間的關系 見表3。表3 ΔNp73在乳腺癌中表達與淋巴結轉移之間的關系淋巴結轉移情況注：χ2=12.724，P=0.001
3 討論
腦膠質瘤是起源于神經外胚層細胞多種腫瘤的總稱[5]，其中惡性膠質瘤在原發性腦瘤中占35%～45%。根據 WHO 1997年病理分級標準，惡性膠質瘤主要包括WHOⅡ級膠質瘤、退變型星形細胞瘤Ⅲ級和多形性膠質母細胞瘤 Ⅳ級。惡性膠質瘤常呈浸潤性生長[6]，且多處于腦部重要結構，手術無法做到徹底切除，總體預后極差[7]。對人類的健康構成了極大的威脅，但其病因和發病機制還不清楚[8]。
本研究結果表明，ΔNP73在生存期>5年的惡性腦膠質瘤患者中陽性表達率，與生存期≤5年的陽性表達率相比，兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)，提示ΔNp73基因的陽性表達是影響患者預后的因子。
ΔNP73在淋巴結轉移的患者中陽性率與無淋巴結轉移的患者中陽性率之間存在差異(P<0.05)，表明ΔNp73的過表達與腦膠質瘤的淋巴結轉移相關，可以認為它在腦膠質瘤患者的淋巴結轉移過程中起某種作用。但通過那些途徑對淋巴結轉移起作用，有待進一步研究。
在低級別及中、高級別的腦膠質瘤中，ΔNp73的陽性表達率之間差異無統計學意義(P>0.05)，表明ΔNp73過表達與乳腺癌病理分級無關。
本實驗表明，ΔNp73在腦膠質瘤組織中陽性表達的患者，總體預后較陰性表達的患者差，且ΔNp73的表達程度與淋巴結的轉移密切相關。淋巴結轉移是公認的預后指標，因此ΔNp73的陽性表達程度可作為腦膠質瘤患者預后評估的一項重要指標，但其作用的詳細機制還需進一步研究。
【參考文獻】
[1] Bozzetti, Cecilia N, Rita M, et al.P73 and P53 pathway in human breast cancers [J]. Clini Oncol, 2006, 25(11):1 4511 453.
[2] Domínguez, José M García, Cristina P, et al.ΔTAp73 upregulation correlates with poor prognosis in human tumors: Putative in vivo network involving p73 isoforms, p53, and E2F1[J].Clini Oncol, 2006, 24(2):805815.
[3] 張云杰,李保慶,單保恩.ΔNp73與人類腫瘤[J].河北醫科大學學報,2009,30(1):101104.
[4] 張濤,賈海英,王繼群,等. P53 、P63 、P73 在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中表達的臨床意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008,10(22):919921.
[5] 楊勁松,王高仁,陸雪官. 腦膠質瘤術后放射治療預后因素研究進展[J].中國腫瘤, 2005,14(2):103106.
[6] 梁冶矢,劉波,回允中,等.腦膠質瘤病人的生存分析[J].腫瘤,2001,21(2):111113.
【關鍵詞】質子磁共振波譜;顱內腫瘤;多體素;鑒別診斷
Comparative study of high-grade gliomas and brain metasmses with multivoxel proton magnetic resonance spectroscopy
WANG Yan-bing,XU Rui,ZHANG Tong.Department of Radiology,The People,s Hospital of Rizhao,Shandong 276826,China
【Abstract】 Objective To investigate the value in MR spectrum in differentialdiagnosis between high grade gliomas and metastases.Methods 30 cases of patients who confirmed by histopathologic findings or clinical follow-up were collected.Using a GE Signa EXCITE HD 3.0T super conduct MR unit,all the cases of patients were performed conventional MR scan and mutlti-voxel with 2-D mutlti-voxel PRESS 144 ms.Functool software was used for post-processing of spectrum.The ratios of NAA/Cr,NAA/Cho,Cho/Cr were measured in the solid part of masses,circum of tumors and contralateral parenchyma respectively.The result was used as the statistical method by SPSS13.0 software.Results In the solid part of masses,there were significant differences between high grade gliomas and metastases in the ratios of Cho/NAA(P
【Key words】
1H-magnetic resonance spectroscopy; Gliomas; Multivoxel; Differential diagnosis
高級別膠質瘤和腦轉移瘤是顱內較常見的腦腫瘤,CT和常規MRI是檢查二者的主要方法,但對于二者的鑒別診斷有一定的難度,尤其對于轉移瘤單發或膠質瘤多發的患者就更難以鑒別。核磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy,MRS)是一種利用磁共振化學位移現象來測定人體內部器官及組織代謝、生理生化改變的定量分析方法[1],可用于觀察顱內腫瘤的生化和代謝物的變化。本文通過3.0T MR儀進行多體素1H-MRS分析高級別腦膠質瘤和轉移瘤瘤體及瘤周代謝物的成分及變化,探討多體素1H-MRS在高級別腦膠質瘤與腦轉移瘤中診斷及鑒別診斷的臨床應用價值。
1 資料與方法
1.1臨床資料 選取青島市立醫院及日照市人民醫院自2006年8月至2009年12月臨床資料齊全、經手術病理或臨床確診的30例腦腫瘤患者,其中高級別膠質瘤患者17例(參照WHO 2007年分級標準,間變型星形細胞瘤6例,膠質母細胞瘤9例,髓母細胞瘤1例,大腦膠質瘤病1例),男11例,女6例,年齡35~69歲,平均46.2歲;腦轉移瘤患者13例,年齡41~76歲,平均59.5歲,其中肺癌轉移9例,乳腺癌轉移2例,結腸癌轉移1例,1例來源不明。
1.2 方法
1.2.1 儀器及掃描參數 采用美國GE公司 Signa EXCITE HD 3.0T超導型MR掃描儀,對30例患者分別行常規MRI平掃、多體素化學位移成像(chemical shift imaging,CSI)MRS檢查、MR增強掃描。常規MRI平掃時使用標準正交頭線圈,取仰臥位,以快速自旋回波(fast spin echo,FSE)序列進行頭部橫斷位的T1加權像(T1 weighted imaging,T1WI)及橫斷、矢狀和冠狀位的T2加權像(T2 weighted imaging,T2WI)掃描。T2WI是重要序列,要求橫斷、矢狀和冠狀位三個方向的掃描互相垂直,采用重復時間(repetition time,TR)4000 ms,回波時間(echo time,TE)104 ms,視野(field of view,FOV)18 cm,矩陣512×336,層間隔1 mm,層厚5 mm。MRS檢查以T2WI圖像作為波譜定位像,采用2D多體素點解析波譜序列(point-resolved selective spectroscopy,PRESS),掃描參數:TR1000 ms,TE144 ms,層間隔2 mm,層厚10 mm,FOV 16 cm,矩陣16×16,成像時間260 s;感興趣區(region of interest,ROI)盡可能涵蓋腫瘤實質、壞死區、水腫區以及對側正常腦組織,避開骨骼、脂肪以及含氣結構等;掃描周邊加用飽和帶以避免其他組織的干擾,掃描前均進行勻場、抑水,保證基線平穩,數據準確,勻場要求水共振峰的半高線寬(FWHM)98%。采集完CSI數據后靜脈注射釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA),采用FSE T1WI序列掃描橫斷、矢狀、冠狀圖像,并與T2WI的層面保持一致。
1.2.2 圖像后處理 所得1H-MRS數據在GE ADW4.2工作站采用Functool3.1軟件包進行后處理,分別測定瘤體區(平掃T1WI低信號,T2WI高信號,增強后無明顯強化或者強化的區域,同時排除囊變壞死區)、瘤體周圍水腫區(腫瘤常規影像學邊緣區,平掃T1WI低信號,T2WI高信號,FLAIR上信號高于病灶實質,無明顯強化)及對側正常腦組織或同側遠離病灶區域(平掃和增強都未見異常信號)的各代謝物值及Cho/Cr、Cho/NAA、NAA/Cr等比值,重建出化學位移偽彩圖,計算每個主峰曲線下面積。
1.3 統計學處理 本研究數據為計量資料,全組數據資料采用SPSS13.0軟件進行處理,首先對所有數據進行正態性分布和方差齊性檢驗,兩組數據比較采用t檢驗,所有統計結果以x±s形式表示。P
2 結果
2.1 高級別腦膠質瘤及腦轉移瘤的MR表現 17例高級別膠質瘤中(Ⅲ-Ⅳ級膠質瘤),平掃表現為大片狀長T1、長T2信號,邊界欠清楚,瘤周水腫較明顯,增強掃描表現為花環或不規則狀強化,3例表現為較均勻強化。13例腦轉移瘤平掃呈長T1、長T2信號,瘤周均表現為大片狀水腫,增強后8例表現為環狀強化,其余表現為團塊狀強化。
2.2 腦高級別膠質瘤及腦轉移瘤的1H-MRS表現
2.2.1 高級別膠質瘤的1H-MRS表現 17例腫瘤瘤體實質部分區域Cho/Cr、Cho/NAA比值均較健側區域明顯升高,而NAA/Cr比值降低(圖2)。明顯升高的脂質(Lip)峰及Lac峰在高級別膠質瘤的實質和壞死區域中均可顯示(圖2A),瘤周水腫區域可見異常波譜(圖2B)。8例病灶實質區發現Lac峰;除1例膠質母細胞瘤外,其余16例高級別膠質瘤均顯示Lip峰。瘤周水腫區域可見異常波譜,近側可見明顯異常波譜,至遠側Cho逐漸降低,NAA值、Cr值逐漸升高,直至成為正常譜線。瘤體及瘤周區波譜定位圖見圖2C。
2.2.2 腦轉移瘤1H-MRS表現 13例腫瘤瘤體實質區Cho/Cr、Cho/NAA比值均較健側區域升高,而NAA/Cr比值降低(見圖2A),8例見Lac峰升高,7例Lip峰升高;瘤周近側水腫區域未見異常波譜(圖2B)。瘤體及瘤周區波譜定位圖見圖2C。
2.3 高級別腦膠質瘤與腦轉移瘤代謝物比值及結果比較 高級別膠質瘤與腦轉移瘤瘤體區、瘤周區各代謝物比值結果以(x±s)形式表示(見表1);全組資料采用SPSS13.0軟件進行處理(P
表1
兩組腫瘤的瘤體區、瘤周區各代謝物比值(x±s)
組別Cho/CrCho/NAANAA/Cr
高級別膠質瘤瘤體區4.148±1.6724.166±2.9411.548±1.156
瘤周區2.058±0.5501.659±0.8551.077±0.433
腦轉移瘤瘤體區3.831±1.7622.194±1.2952.008±0.789
瘤周區1.132±0.2360.907±0.3751.405±0.455
表2
兩組腫瘤瘤體區、瘤周區各代謝物比值
兩兩比較(P值)
變量Cho/CrCho/NAANAA/Cr
瘤體區0.63580.03550.2422
瘤周區0.00010.01930.1458
3 討論
近年來多體素氫質子核磁共振波譜對腦腫瘤的診斷和鑒別診斷已經在臨床得到廣泛應用,對于高級別膠質瘤與腦轉移瘤的鑒別診斷具有非常重要的價值,尤其在轉移瘤單發或膠質瘤多發而臨床表現和病史又不能提供鑒別,單靠常規CT及MR圖像難以作出正確診斷時更具有重要意義。顱內腫瘤的常見代謝物有N-乙酰天門冬氨酸(NAA)、膽堿(Cho)、肌酸(Cr)、乳酸(Lac)、 脂質(Lip)、肌醇(myoinositol,MI)等。目前波譜檢查技術包括單體素波譜(single voxelspectroscopy)、多體素波譜(multi-voxel spectroscopy),后者又分為二維MRS和三維MRS,即化學位移成像(CSI)。MRS常用序列是點分辨波譜分析法(PRESS)和激勵回波探測法(STEAM)。PRESS用于長回波時間TE(135-270 ms),可獲得長T2物質的波譜(如NAA、Cr、Cho、Lac等),對運動不敏感,基線穩定,信噪比(SNR)亦比STEAM要高,而且易于定量[2]。由于本研究觀測的主要代謝物大都是長T2物質,所以本研究采用PRESS序列。多體素MRS可了解腫瘤的實質部位、瘤周水腫區及腫瘤周圍信號正常區域等部位的代謝變化,可提供多個興趣區的代謝信息,更加便于對高級別膠質瘤和轉移瘤二者的鑒別,還可進一步確定病灶的邊緣,利于手術和放療時盡量減少對正常腦組織的損傷。3.0T MRS較1.5TMRS最明顯的優勢是信噪比(SNR)可提高23%~46%,信號采集時間明顯縮短,波譜分辨率更高,基線更加穩定[3]。并可發現1.5T MRS未能檢出的某些具有重要意義的代謝物峰,可設定較小體素,更能確切反映體素內組織代謝情況,改善波譜空間分辨率。體積小于1.0 cm3(1.5T核磁共振波譜體素的上限)的體素在不增加檢查時間的情況下,仍可獲得足夠的信噪比,從而克服了勻場、水抑制及快速空間編碼上的技術障礙。Inoue[4]等曾報道一例發生在右頂枕葉大腦深層白質內直徑小于15 mm的膠質瘤,用3.0TMRS能夠檢出,而1.5TMRS未能測出。因此,超高場強MR成像系統將提高MRS在腦腫瘤診斷中的應用價值。
3.1 高級別膠質瘤與腦轉移瘤腫瘤強化區1H-MRS表現 高級別膠質瘤為顱內較常見的腫瘤,是由腫瘤性星形細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞或者脈絡膜細胞產生的。高級別膠質瘤其典型的波譜為NAA峰顯著下降,Cr峰中等下降和Cho峰明顯升高。腦轉移瘤沒有星形細胞或神經元,主要表現為NAA峰缺乏,Cho明顯增高,Cr下降或消失,Cho/Cr比值升高,可出現Lac峰和Lip峰。盡管顱內腫瘤的1H-MRS研究揭示了幾乎所有腫瘤與正常腦組織波譜表現均存在差異,但這些差異在不同的腫瘤之間缺乏特征性[5]。本研究中高級別膠質瘤與腦轉移瘤瘤體實質區Cho/Cr 值分別為(4.148±1.672)、(3.831±1.762),NAA/Cr值分別為(1.548±1.156)、(2.008±0.789),兩者Cho/Cr、NAA/Cr比值比較無統計學意義,而Cho/NAA值分別為(4.166±2.941)、(2.194±1.295),兩者比較差異有統計學意義,這可能與轉移瘤神經元缺乏有關。有文獻[6]報道腦轉移瘤與高級別膠質瘤組相比,Cho/Cr、NAA/Cr值比較差異無統計學意義,并認為惡性程度較高的腫瘤,其波譜表現相似。與本研究結果相符。Lac是能量代謝低能通路-葡萄糖無氧酵解的終產物,常見于腫瘤增長過快。Lip常見于腫瘤壞死、脂質析出,而惡性腫瘤更容易發生壞死,故使其成為較有意義的鑒別腫瘤良惡性的指標。本文在17例高級別膠質瘤中發現Lac峰8例,16例顯示Lip峰,可見Lip峰是最具鑒別診斷意義指標,若出現即高度提示惡性腫瘤。本組腦轉移瘤中轉移灶較小者,無Lip峰,而Lac峰出現時,病灶明顯增大。
3.2 腦膠質瘤與腦轉移瘤瘤周水腫發生機制及代謝物比較 腦膠質瘤、轉移瘤瘤周水腫的發生機理較復雜,一般認為其均為血管源性水腫。局部侵襲是腦膠質瘤的一個顯著特征,膠質瘤內腫瘤新生血管血腦屏障(BBB)不完整,其程度與病理分級有關,腫瘤侵襲范圍與瘤周水腫程度相一致[7]。轉移瘤血管屬有窗性血管,與起源組織血管相同,不具血腦屏障,是腦水腫形成的基礎。本文研究中高級別膠質瘤與腦轉移瘤瘤周區Cho/Cr值分別為(2.058±0.550)、(1.132 ±0.236),NAA/Cr值分別為(1.077±0.433)、(1.405±0.455),Cho/Cr、NAA/Cr值分別比較差異有統計學意義。Law [8]等研究發現膠質瘤瘤周水腫Cho值升高,常規MRI圖像上表現正常的腫瘤周圍無水腫區域腦組織也存在病理性波譜,但轉移瘤則不然,二者Cho/Cr值差異有統計學意義。Smith[7]等亦認為腦轉移瘤和星形細胞瘤的區別在于轉移瘤有清楚的邊界,瘤體鄰近的組織在波譜上無明顯異常表現,膠質瘤在強化區域以外可以顯示異常的波譜。本文研究亦發現高級別膠質瘤瘤周水腫區出現異常波譜,而在腦轉移瘤水腫區未出現異常波譜,與以上研究觀點一致。
總之,H-MRS為研究活體生化、能量代謝提供了一種全新的、無創的方法,當腦高級別膠質瘤與腦轉移瘤在常規MR檢查中鑒別診斷困難時,行多體素波譜檢查可對二者作出較為準確的鑒別診斷,為臨床治療提供更多獨特的信息。
圖1 男,30歲,右額葉膠質母細胞瘤。 A 瘤體區單個體素的譜線圖,表現為高聳的Cho峰,明顯降低的Cr峰,明顯升高的Lip峰;B 瘤周區單個體素譜線圖,表現為異常波譜;C 右額葉膠質母細胞瘤波譜定位圖。
圖2 男 64歲 肺癌腦轉移瘤。A瘤體區單個體素譜線圖,Cho峰明顯升高,NAA峰明顯降低,可見 Lip峰;B 瘤周區單個體素的譜線圖,表現為正常波譜;C 腦轉移瘤波譜定位圖
參考文獻
[1] McKnight TR.Proton magnetic resonance spectroscopic evaluation of brain tumor.Metabolism Semin Oncol,2004,31:605-617.
[2] Martin RC,Sawrie S,Hugg J,et al.Cognitive correlates of 1H MRSI-detected hippocampal abnormalities in temporal Lobe epilepsy.Neurology,1999,53(11):2052-2058.
[3] Gonen O,Gruber S,Li BS.Multivoxel 3D proton spectroscopy in the brain at 1.5T versus 3.0T:Signal-to-noise ratio and resolution comparison.AJNR,2001,22(9),1727-1731.
[4] Inoue T,Ogasawara K,Kumabe T,et al.Minute glioma identified by 3.0 Tesla magnetic resonance spectroscopy-case report.Neurol Med Chir,2005,45(2):108-111.
[5] Kienlin M,Ziegler A,FurY,etal.2D-spatial/2D-spectral spectroscopic imaging of intracerebral gliomas in rat brain.Mag Res Med,2000,43:211.
[6] 陳增愛,耿道穎,沈天真.質子磁共振波譜對腦腫瘤的鑒別診斷價值.中國醫學計算機成像雜志,2001,7:217.
[7] 林志雄,張鵬飛,江常震,等.人腦膠質瘤侵襲微生態系統的形態學觀察.解剖學報,2002,33(4):355-359.
【關鍵詞】 腫瘤，神經上皮;存活素;livin;免疫組織化學
【摘要】 目的 探討存活素(survivin)和livin蛋白在腦膠質瘤的表達情況及其與腫瘤惡性程度之間的相互關系。方法 應用免疫組織化學方法檢測72例腦膠質瘤標本survivin及livin蛋白的表達強度、陽性細胞百分比及其與膠質瘤組織學分級之間的關系。結果 survivin及livin蛋白表達陽性染色主要位于腦膠質瘤細胞的胞漿，并與腦膠質瘤的組織學分級相關，各級之間差異有統計學意義(p<0.05)，隨著腦膠質瘤惡性程度增高，survivin與livin的表達強度和陽性細胞百分比也隨之逐漸增加，且兩者表達呈正相關(r=0.353，p<0.01)。結論 survivin和livin蛋白在腦膠質瘤呈過度表達，并與腦膠質瘤的惡性程度密切相關，兩者的激活在膠質瘤的發生發展過程中可能起協同作用。
【關鍵詞】 腫瘤，神經上皮;存活素;livin;免疫組織化學
expression and significance of livin and survivin in brain glioma zhao libin,zhao yonghong,he hongmei,et al. tcm hospital of funing country,hebei, funing country 066001,china
【abstract】 objective to investigate the expression and significance of survivin and livin in brain glioma. methods the expression of survivin and livin in 72 patients with brain glioma were detected by immunohistochemical technique. the relationship between the expression of survivin and livin and the histological grades was analyzed. results survivin and livin was over-expressed in gliomas and the expression levels were related to the histological grades of gliomas, and the expression levels of survivin and livin in the gliomas with higher malignancy were significantly increased(p<0.05),and there was significant difference between the expression of survivin and livin in the gliomas of different grades,and the expression of survivin was positively related with that of livin(r=0.353,p<0.01).conclusion survivin and livin is over-expressed in gliomas,which is related to the malignancy of the tumor,there may be some correlations between their activation.
【key words】 tumor,neurepithelium; survivin; livin; immunohistochemistry
腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，由于膠質瘤具有較強的侵襲潛能，因而術后復發率極高，成為影響預后的重要因素，為此，人們一直致力于新療法的研究。作為調整抑制蛋白(iaps)家族的新成員livin和存活素(survivin)在多種腫瘤組織中高表達，且最近的研究證實livin和survivin在肺癌、乳腺癌等[1，2]中表達無明顯相關性，表明其可能具有不同的作用機制;survivin除具有凋亡抑制作用外，還有干擾細胞周期、促進細胞增殖和分裂、參與血管生成作用，而livin目前以抗凋亡作用為主，其生物學功能有待進一步的研究。本研究通過采用免疫組織化學方法分別檢測腦膠質瘤組織中survivin和livin的表達情況，以探討兩者在膠質瘤細胞惡性增殖過程中的作用及二者的關系，旨在為膠質瘤的基因治療提供新的途經。
1 資料與方法
1.1 一般資料 收集秦皇島市撫寧縣中醫院神經外科于2003年5月至2008年5月手術切除的腦膠質瘤石蠟標本72例，其中男47例，女25例;年齡21～73歲，平均年齡44.6歲;術前均未經放射治療或化學治療。根據1999年who制訂的中樞神經系統腫瘤分類標準，低度惡性(ⅰ～ⅱ級)34例，中度惡性(ⅲ級)22例，高度惡性(ⅳ級)16例。所有標本常規石蠟連續切片，行he染色和免疫組化染色。he染色的切片由臨床病理學醫師進行病理學觀察核實診斷。對照組的腦組織取自9例因顱腦損傷行內減壓術者。
1.2 主要儀器和試劑 兔抗人survivin多克隆抗體為中山公司產品，livin羊抗人單克隆抗體購自rd公司，免疫組化sp法試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。主要儀器有自動切片機(德國)、抗原微波自動修復儀(上海)、yb6型生物組織包埋機(湖北)、低溫冰箱(日本)、olympus雙目生物顯微鏡(日本)等。
1.3 結果判定標準 采用半定量方法，光鏡下分析。組織切片中，在排除非特異性染色的前提下，細胞的胞漿有黃色、棕黃色、棕褐色顆粒分布即為陽性，記分方法：(1)按切片中細胞染色的深淺程度評分：(-)，無著色，計0分;(+)，細胞染色呈淡黃色，計1分;(++)，細胞染色呈黃色，計2分;(+++)，細胞染色呈棕黃色，計3分;(++++)，細胞染色呈棕褐色，計4分;(2)計算染色陽性細胞所占比例，每例隨機觀察5個高倍鏡視野(×400)，每個視野計數100個細胞，計數500個細胞中染色陽性細胞百分比。
1.4 統計學分析 應用sas 11.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗和speaman等級相關分析，p<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 2組survivin與livin蛋白的表達比較 survivin與livin蛋白在對照組中均為陰性表達。2組survivin和livin蛋白陽性表達率間差異有統計學意義(p<0.05)。見表1。表1 2組survivin與livin蛋白表達比較例
2.2 survivin與livin在不同級別腦膠質瘤組織中的表達 survivin蛋白表達陽性率在腦膠質瘤低、中、高度惡性組中分別為32.35%(11/34)，45.45%(10/22)和75.0%(12/16)，3組比較差異有統計學意義(χ2=7.97，p<0.05)。livin蛋白表達陽性率在低、中、高度惡性組分別為44.12%(15/34)、59.09%(13/22)和81.25%(13/16)，3組差異有統計學意義(χ2=6.18，p<0.05)。
2.3 腦膠質瘤中survivin與livin表達的關系 在72例膠質瘤中survivin與livin共陽性26例，共陰性24例，spearman等級相關分析表明，二者的表達呈正相關(r=0.353，p<0.01)。見表2。表2 人腦膠質瘤中survivin與livin表達的關系例
3 討論
livin是凋亡抑制蛋白家族新成員，特異性高表達于多種腫瘤組織，它具有抗細胞凋亡的作用，并可使腫瘤對放化療抵抗。livin在生理狀態下，通過凋亡途徑清除體內衰老和異常的細胞，有利于維持體內組織的動態平衡。livin過度表達在腫瘤中直接或間接抑制凋亡，不僅有利于細胞的繼續增殖，還有利于異常基因的進一步積聚，促使細胞惡性轉化，從而有利于腫瘤的進展[3]。有研究表明livin可能成為腫瘤治療的又一靶點[4,5]。livin在胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、黑色素瘤、白血病等呈高表達。hariu等[6]研究表明livin與肺癌有一定的相關關系，他們應用rtpcr方法檢測livin可在許多肺癌細胞株和原發性肺癌組織中呈異常表達，而在正常的肺組織中卻未見表達。本研究采用免疫組織化學方法檢測livin在72例腦膠質瘤組織和9例腦外傷組織中的表達情況，結果表明正常腦組織中無livin陽性表達，膠質瘤組織中livin的總陽性表達率為56.94%(41/72)，差異有統計學意義(p<0.01)。本研究還發現，隨著腦膠質瘤病理分級的升高，livin的表達增強，因此livin可作為膠質瘤惡性程度評估的標志物。
在正常情況下，survivin僅在胚胎組織中有顯著表達，在大多數人類常見腫瘤如肺癌、結直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌等中表達異常升高。美國國立癌癥研究中心的抗癌藥物篩選計劃所選用的60種腫瘤細胞系中均可發現survivin的陽性表達，研究提示survivin可通過抑制凋亡通路下游的caspase和caspase7發揮抗凋亡作用。本研究結果顯示survivin在人腦膠質瘤中的陽性表達率明顯高于正常腦組織，且survivin蛋白表達陽性率隨腫瘤的惡性程度增高而呈現逐漸升高的趨勢。膠質瘤低、中度惡性與高度惡性之間、ⅲ級與ⅳ級之間survivin蛋白表達陽性率均存在著顯著性差異，說明組織學分級越差，survivin陽性表達率越高，表明該基因的過表達在腦膠質瘤的發生發展中起著較為重要的作用，并與腫瘤的組織病理學分級及良惡性程度有關。
人們對survivin在腦膠質瘤的表達也進行了較深入的研究。chakravarti等[7]用半定量western印跡檢測了92例腦膠質瘤患者手術標本中survivin蛋白的表達，發現陽性表達率為64%(59/92)，表達陽性的患者中位存活期僅為11個月，而表達陰性的33例患者中位存活期則為64個月，二者存活期之間差異顯著。在惡性程度最高的多形性膠質母細胞瘤，survivin陽性表達率為80%(45/56)，明顯高于非多形性膠質母細胞瘤的陽性表達率(39%)[7]，且survivin陽性表達的多形性膠質母細胞瘤患者平均存活時間明顯短于survivin陰性表達者;同時還發現survivin表達水平越高，凋亡蛋白caspase3表達水平越低，患者預后也越差[8]。研究表明，通過腺病毒載體，運用rna干擾技術抑制survivin表達，能夠抑制腫瘤生長[9]。
本研究結果表明，survivin蛋白在正常腦組織中無表達，在腦膠質瘤中過度表達，并與腦膠質瘤的組織學分級相關，各級之間差異顯著，隨著腦膠質瘤惡性程度增高，survivin的表達強度和陽性細胞百分比也隨之逐漸增加，提示survivin在腦膠質瘤的惡變過程中起重要作用，survivin基因在膠質瘤中高表達的特性提示它可能是一個有效的膠質瘤基因治療靶點。
另外，livin和survivin基因也是腫瘤耐藥的關鍵，這兩基因有可能成為解決腫瘤耐藥性的突破口。本實驗結果表明，在人腦膠質瘤中survivin與livin的表達呈正相關關系。說明在腦膠質瘤中survivin的再激活與livin的表達不是兩個孤立事件，兩者共同促進了膠質瘤的發生發展。因此，survivin、livin在腦膠質瘤組織中的表達上調對膠質瘤的發生、發展起重要的促進作用，并且其表達率與腫瘤的病理分級、惡性程度呈起正相關。盡管其具體的作用機制尚不明確，但對膠質瘤中凋亡抑制因子survivin、livin的表達研究，有助于理解膠質瘤的生物學特性，從而為膠質瘤基因治療靶點的選擇和進一步的臨床治療提供依據。
【參考文獻】
1 tanabe h，yagihashi a，tsuji n，et al.expression of surviving and livin mrna in nonsmallcell lung cancer.lung cancer，2004，46：299304.
2 yagihashi a，olunura t，asanuma k，et al. detection of autoantibodies to surviving and livin in sera from patientswith breast cancer.lung cancer，2005，362：125130.
3 irena crnkovicmertens，thomas m，michael m，et al.the antiapoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells.lung cancer，2006，54：135142.
4 crnkovicmertens i，semzow j，hoppeseyler f，et al.isoformspecific silencing of the livin gene by rna interference defineslivin beta as key mediator of apoptosis inhibition in hela cells. mol med，2006，84：232240.
5 孫建國，廖榮霞，陳正堂，等.livin異構體特異性基因沉默誘導肺腺癌spca1細胞凋亡.中國癌癥雜志，2005，1：505509.
6 hariu h，hirohashi y，torigeo t，et al.a berrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，livin/mliap in lung cancer.clin cancer res，2005，11：10001009.
7 chakravarti a,noll e,black pm,et al.quantitatively determined survivin expression levers are of prognostic value in human glimoas.j clin oncol,2002,20:10631068.