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【摘要】
目的利用膜分離技術分離純化白藜蘆醇，減少污染。方法虎杖苷液態發酵后濃縮，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常溫下提取，過濾得到濾液，然后將濾液用兩級膜進行處理，用高效液相色譜（HPLC）法檢測白藜蘆醇的純度。結果經微濾膜處理后白藜蘆醇的純度達30.5%，再經超濾膜處理，純度達55.8%。結論該方法可降低生產成本，不使用有毒有害的溶劑，實現清潔生產。
【關鍵詞】 膜分離技術； 白藜蘆醇； 清潔生產
Abstract：ObjectiveThe membrane separation technology used in the purification of resveratro and reducing pollution were studied. Methods After liquid state fermentation， resveratro was extracted by 60% ethanol at room temperature， solid/liquid ratio 1:8， the filtrate was obtained by filtering， and dealt it with two membrane equipments ， the purity of resveratrol was detected by HPLC . ResultsThe purity of Resveratro reached 30.5% after the microfiltration membrane， and after the ultrafiltration membrane the purity of resveratro could reach 55.8%.ConclusionThis method can reduce the cost of production without toxic and harmful solvents and it can realize clean production.
Key words：Membrane separation technology； Resveratro； Clean production
虎杖苷是蓼科蓼屬虎杖干燥根莖中的一種有效成分，也可稱為白藜蘆醇苷。虎杖苷在植物中分布廣，含量高，具有較強的生物活性。虎杖中的虎杖苷的含量在2%左右［1］。白藜蘆醇也是虎杖的有效成分之一，其含量在0.1%～0.2%之間，屬于多酚類化合物。白藜蘆醇有化學抗癌活性，同時具有抑制血小板凝聚、保護缺血器官、抗氧化及抑菌等重要的作用［2］，是目前世界上一種最新的藥用保健活性物質。目前，該產品國際市場需求量大，具有良好的市場前景。傳統純化白藜蘆醇的方法主要是大孔樹脂吸附，這種方法主要存在原料消耗大、產品純度不高、生產周期長、使用有毒化學物質多、污染大等缺點。本實驗利用膜分離技術純化白藜蘆醇。報道如下。
1 材料和方法
1.1 儀器、原料、試劑和設備虎杖苷粗提物（粉末狀，虎杖苷含量14.78%）；白藜蘆醇標準品（成都思科華有限責任公司）；乙醇（工業純）；HPLC：戴安VWD3100(配有：紫外檢測器單通道LPG3400四元梯度泵真空脫氣機自動進樣器柱溫箱浙大化學工作站)； AN0298分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）； 膜設備HGDM-1（湖北工業大學膜技術研究所研制）； 膜設備HGDM-2（湖北工業大學膜技術研究所研制）。
1.2 方法
1.2.1 白藜蘆醇的HPLC法檢測色譜柱C18柱（4.6 mm×150 mm）， 柱溫25 ℃；流動相甲醇-水為40∶60；流速1 ml/min；進樣量20 μl；檢測波長305 nm。根據標準樣的峰面積和進樣濃度作回歸曲線，白藜蘆醇的回歸方程為Y = 1.40×108X +1.21×104，相關系數r=0.999 913，在20 ～100 μg/ml范圍內和峰面積呈線性關系；虎杖苷的回歸方程為Y=9.61×107X-1.84×105，相關系數為r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范圍內和峰面積呈線性關系。
1.2.2 實驗過程白藜蘆醇分離純化流程見圖1。
圖1 兩級膜分離純化白藜蘆醇流程圖（略）
虎杖苷液態發酵后濃縮，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常溫下提取，過濾得到濾液，然后將濾液連續投入微濾膜裝置中，收集其濾液，再將濾液投入超濾膜裝置中，收集其濾液。超濾膜的濃縮液中含有大黃素，可以回收利用。實驗過程中分別記錄時間、操作壓力、溫度、膜通量等數據。
1.2.3 膜的清洗本實驗完成后，微濾膜和超濾膜需要清洗，以恢復膜的水通量。先用復合清洗劑清洗 ，然后用次氯酸鈉漂洗，最后用清水洗至中性。觀察膜清洗前后的通量變化情況。
2 結果
2.1 微濾膜除雜的結果取物料5 kg進行提取，得到提取液79 kg。取一定量的提取液烘干，再用HPLC檢測，白藜蘆醇的純度為8.7%。將提取液連續投入微濾膜裝置中，出料71.4 kg，用時5.88 h，平均通量為60.70 L·m-2·h-1。我們考察了微濾膜在進口壓力為0.9 MP，出口壓力為0.7 MP，操作溫度控制在45℃左右，流速為4.0 m/s的條件下，膜通量隨時間的變化關系。見圖2。
由圖2可以看出，開始運行時，膜的通量為124.2 L·m-2·h-1，由于冷的料液的加入，系統的溫度有所降低，所以通量有所下降。隨著運行時間的延長，溫度恒定，由于濾餅的形成和膜的壓實作用或膜被污染、膜孔被堵塞，造成水通量開始慢慢衰減。衰減到一定程度后，由于膜表面形成了穩定的凝膠層，通量趨于穩定。停機時通量為47.3 L·m-2·h-1。
微濾膜主要是截留脂肪、蛋白等一些大分子雜質。取一定量的濾液烘干，再用HPLC檢測，白藜蘆醇的純度為30.5%，白藜蘆醇的純度得到了提高。
2.2 超濾膜濃縮分離的結果將微濾膜得到的濾液71.4 kg連續加入超濾膜裝置中，出料60.9 kg，耗時3.2 h，平均通量為11.08 L·m-2·h-1。我們研究了超濾膜在進口壓力為1.5 MP，出口壓力為1.42 MP，操作溫度控制在40℃左右，流速為3.5 m/s的條件下膜通量隨時間變化的規律。結果見圖3。
圖2 微濾膜通量隨時間的變化曲線（略）
圖3 超濾膜通量隨時間的變化曲線（略）
由圖3可以看出，開始運行時，膜的通量為15.9 L·m-2·h-1 ，隨著運行時間的延長，膜被污染，膜孔被堵塞，通量持續下降，80 min后，通量衰減比較緩慢，停機時的通量為9 L·m-2·h-1。取一定量的濾液烘干，再用HPLC檢測，白藜蘆醇的純度為55.8%。
2.3 膜的清洗結果結果見表1。
表1 膜清洗結果（略）
由表1可以看出膜清洗后的通量可以恢復到99%以上，所以可以實現連續生產。
2.4 精制將超濾膜的濾液進行濃縮，回收酒精，將濃縮液用石油醚萃取再結晶，此時白藜蘆醇的純度可以達到95%以上。
3 結論
膜分離技術是21世紀的一項高新技術，包括微濾、超濾、納濾、電滲析、反滲透、膜電解、膜蒸餾、膜萃取等各種技術［3］，具有能耗低、操作溫度低、無相變、不改變體系的化學性質，結構簡單、占地小、操作簡便易于實現自動化、污染小等優點。
提取液烘干后，白藜蘆醇的純度為8.7%，采用微濾膜對其進行除雜處理，白藜蘆醇純度達到了30.5%。整個運行過程中，膜通量較高，平均通量為60.7 L·m-2·h-1。
采用超濾膜對微濾膜濾液進行濃縮分離處理，得到的白藜蘆醇的純度為55.8%。整個運行過程中，膜保持良好的通量，平均通量為11.08 L·m-2·h-1。
微濾膜和超濾膜經清洗后，膜通量恢復到原來的99%以上。
整個過程無廢水產生，能耗低，可降低生產成本，實現清潔生產的目的。
參考文獻
［1］ 高守紅，楊少麟，范國榮.虎杖苷的研究進展［J］.藥學實踐雜志，2005，23（3）：145.
【關鍵詞】
虎杖；白藜蘆醇；提取分離；研究
虎杖為蓼科植物虎杖的根莖，主要含有[1]蒽醌類、二苯乙烯類、水溶性多糖和鞣質等成份。白藜蘆醇和白黎蘆醇苷是虎杖的主要功效成分。白藜蘆醇作為一類親脂性多酚物質，具有抗血小板凝聚，保護肝臟，抗腫瘤活性等藥理作用，特別是對心腦血管系統具有較強的藥理活性。本實驗采用酶法實驗，對虎杖中的白藜蘆醇進行提取分離，本研究旨在為虎杖開發利用提供科學依據。
1儀器與試藥
1.1儀器Agilent1100高效液相色譜儀；AG285分析天平；KS-600d超聲清洗器；Delta320pH計；HHW420型三用恒溫水箱。
1.2試藥虎杖粉末，批號：20060829；纖維素酶，批號：F20071116；植物水解酶、植物提取酶；白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1535-200001，純度：99.5%；甲醇、乙醇、磷酸、磷酸二氫鉀（分析純）；乙腈（色譜純）；蒸餾水。
2方法與結果
2.1白藜蘆醇的測定方法
色譜條件色譜柱ODSC18；流動相乙腈∶水（0.02%磷酸）30∶70；流速1ml/min；柱溫30℃；檢測波長303nm；20μl進樣環。理論塔板數不低于3000；分離度大于1.5。精密稱取干燥白藜蘆醇對照品330μg，置10ml容量瓶中加甲醇制成濃度33μg/ml的溶液作為對照品溶液[2]。
2.2單因素考察①試樣的制取：精密稱取虎杖粉末若干份，每份約0.1g，再每份加入pH=5.0緩沖鹽溶液5ml。搖勻，在45℃酶解18h后，加入20ml95%乙醇超聲提取30min，取出放冷，定容至25ml，搖勻，過濾，取續濾液。②酶種類的篩選：取試樣3份，1份不加酶，其他2份分別加入10mg纖維素酶和植物水解酶，并按色譜條件進行測定，對于沒有加入任何酶的試樣，虎杖中白藜蘆醇含量為1.8/mg/g-1，加入纖維素酶試樣中白藜蘆醇含量為4.6/mg/g-1，加入植物水解酶的試樣中白藜蘆醇含量為9.1/mg/g-1。由測定結果可知，植物水解酶處理效果最好，白藜蘆醇含量最高，與不加入任何酶的試樣相比較，白藜蘆醇含量提高了4倍。③溫度的選擇：酶的活性與溫度有關，各種酶的溫度需求不同。一般來說[3]，溫度越高，酶的反應速度越快，但當溫度過高時，部分酶可能會失去活性，一般酶的酶解溫度是在30℃～60℃左右，故在實驗中分別選取30℃、40℃、50℃和60℃四個溫度段。取試樣4份試樣，分別置于不同的溫度段中，30℃時，白藜蘆醇回收率為0.82%；40℃時，白藜蘆醇回收率為1.57%；50℃時，白藜蘆醇回收率為1.49%；當是60℃時，白藜蘆醇回收率為1.31%，由此可見，酶解的最適宜溫度為40℃左右。④酶解時間的選擇：根據酶的活性及溫度需求，還要找出酶解的時間。取4份試樣，分別進行3h，5h，7h，9h時間的酶解，經過不同的時間段后，3h后的白藜蘆醇回收率為0.52%，5h后的白藜蘆醇回收率為1.32%；7h后的白藜蘆醇回收率為1.79%；9h后的白藜蘆醇回收率為1.38%，由以上數據可知，酶解最適宜的時間為7h。⑤酶解pH值及酶量的選擇：采用以上的方法步驟，實驗后通過數據分析可知，虎杖專用酶最適酶解pH=3.0，酶含量為原藥材的30.0%。
3討論
近年來，隨著科技及研究的不斷進展，人們對虎杖白藜蘆醇提取分離已取得了一定的進展，一些新的技術和手段不斷應用于這一領域，為白藜蘆醇提取提供了更科學的方法[4]。本試驗采用的白藜蘆醇測定方法，條件比較穩定，分離效果好，可用于虎杖及其制劑的含量測定。
參考文獻
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[關鍵詞] 4-羥基白藜蘆醇甲基化物；3，4，5-三甲氧基苯甲酸；格利雅試劑；縮合反應
[中圖分類號] R944.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2012）12（c）-0030-02
白藜蘆醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxy-trans-stilbene）即反式3，4′，5-三羥基茋，廣泛存在于虎杖、葡萄、花生等多種植物中。白藜蘆醇作為一種重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病等活性[1-5]，被譽為繼紫杉醇后的第二大抗癌藥物。4-羥基白藜蘆醇（4-hydroxy resveratrol，3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯）是白藜蘆醇的羥基衍生物，實驗證明4-羥基白藜蘆醇對癌細胞的生長有明顯的抑制作用[6-7]，且抗氧化活性遠強于白藜蘆[8-10]，目前尚無天然動植物提取4-羥基白藜蘆醇的報道，因此化學合成成為了制備4-羥基白藜蘆醇與其衍生物的重要方法[10-12]。但是由于多羥基的存在不易保存，一般將其進行甲基化修飾，增強穩定性，增大其生物利用度。
茋類化合物合成方法主要有經三苯基膦的烯烴化反應[13]、以對甲氧基苯乙烯和3，4，5-三甲氧基苯基四氟化硼重氮鹽經鈀催化的芳基化反應[10]等，具有原料價格昂貴、來源不易、反應條件苛刻、溶劑毒性大等缺點。本文以3，4，5-三甲氧基苯甲酸為原料，通過還原、鹵代制備3，4，5-三甲氧基氯芐，氯芐制成格利雅試劑與大茴香醛縮合制備了4-羥基白藜蘆醇的四甲基化衍生物，該路線中試劑原料均價廉易得，反應操作簡單，條件溫和。合成路線見圖1。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
旋轉蒸發器RE-52A；循環式真空泵；X-4數字顯示顯微熔點測定儀；ZF7三用紫外分析儀；WQF-200型傅里葉變換紅外光譜儀）；H-NMR（Varian Mercury 400核磁共振儀）；MS（Kratos MS-80型質譜儀）。
1.2 原料與試劑
3，4，5-三甲氧基苯甲酸（張家界貿源化工有限公司）；大茴香醛，BF3/Et2O（國藥集團化學試劑有限公司）；NaBH4（天津市福晨化學試劑廠）；鎂（湖南匯虹試劑有限公司）；SOCl（天津市科密歐化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 3，4，5-三甲氧基氯芐（3）的制備
參照文獻[11-12]制備化合物（4）與（3）。3，4，5-三甲氧基苯甲醇（4）的收率為92.1%，折光率為1.514；IR：3 422.00（O-H），2 940.81（C=C-H），1 593.39（C=C），1 236.50（C-O-C），1 127.03（C-O），1 061.9伯醇（C-O），829.20（1，2，3，5-四取代）。3，4，5-三甲氧基氯芐（3）的收率為94.2%，mp.59～60℃（文獻58～61℃）；1H-NMR（CDCl3，300 MHz），86.60（S，2H），4.42（S，2H），3.88（S，6H），3.85（S，3H）。
2.2 3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂（2）的制備
250 mL的三口燒瓶通入氮氣使瓶內空氣排盡，加入鎂條碎片（1.2 g，0.05 mol），再加少量無水四氨呋喃（THF）覆蓋鎂條，加入碘晶一粒，至溶液微沸，加入3，4，5-三甲氧基氯芐的無水THF溶液，反應2 h，溶液呈灰綠色體系。灰綠色體系即3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂THF溶液 。
2.3 3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯（1）的合成
不經分離，在3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂THF溶液中加入對甲氧基苯甲醛2.0 g，氮氣保護，反應1 h，加硫酸，加熱至沉淀溶解，二氯甲烷萃取，飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，干燥，抽濾，濾液旋蒸除去溶劑，得白色產品，產品經柱層析得白色結晶3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯1.27 g，收率18.4%。mp.159℃（文獻157℃）。1H-NMR（CDCl3）：δ 7.43～7.46（d，2H），7.0（d，1H），6.95～6.87（m，3H），6.72（s，2H），3.91（s，6H），3.87（s，3H），3.83（s，3H）；13C-NMR（CDCl3）：δ159.3， 153.4， 137.6，133.5，130.0，127.8，127.6，126.6，114.2，103.3，61.0，56.1，55.3；MS m/z 301。
3 討論
本文以廉價的3，4，5-三甲氧基苯甲酸為原料，通過還原、鹵代制備3，4，5-三甲氧基氯芐，再經制備格利雅試劑與大茴香醛縮合制備了目標化合物4-羥基白藜蘆醇的四甲基化衍生物，總收率15.96% 。該路線能順利實現4-羥基白藜蘆醇甲基化物的全合成，原料價廉易得，反應條件溫和，操作簡便。但是（1）的合成收率較低，可能是鹵代烴較活潑，在制備格利雅試劑時會生成偶聯副產物導致。該路線能為全合成4-羥基白藜蘆醇的甲基化物提供實驗依據。
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[關鍵詞]白藜蘆醇；乙醇；自發運動；應激反應；行為
[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）08（b）-0015-04
乙醇是一種水溶性以及脂溶性都非常好的極性小分子，對包括血-腦脊液屏障在內的各種生物膜都具有很強的穿透力，對神經系統的功能有顯著影響。動物研究實驗表明，乙醇對機體的運動能力、感覺能力乃至包括學習和記憶在內的高級認知功能都有損傷作用[1-4]。
斑馬魚是一種在發育生物學以及遺傳學研究中被廣泛應用的模式生物，近年來在神經藥理學研究中的應用也逐漸增多。急性乙醇處理對斑馬魚的神經系統功能以及相關的行為學指標也有顯著的影響[5-7]。
白藜蘆醇是一種主要來源于花生、葡萄、藍莓、虎杖等植物的天然多酚類化合物，有明顯的生物活性，具有保護心血管系統、延緩衰老以及抗癌等功效，同時對于乙醇導致的肝臟以及神經系統損傷具有一定的緩解作用[8-10]。
本研究以新興模式生物斑馬魚作為研究對象，探討白藜蘆醇處理對斑馬魚幼魚在急性乙醇作用下自發運動、受激運動的影響。
1材料和方法
1.1動物
野生型AB型斑馬魚來源于復旦大學附屬兒科醫院轉化中心，按照Westerfield所著的書[11]中的方法進行養殖和繁殖，室溫和水溫均為（28.5±0.5）℃，每日14 h光照，10 h黑暗循環（亮燈時間：8∶00，暗燈時間：22：00）。
1.2試劑
乙醇為優級純，國藥集團化學試劑；白藜蘆醇購自Vetec公司；鏈霉蛋白酶購自羅氏公司。
1.3藥物制備
1.3.1鏈霉蛋白酶制備 取1 g鏈霉蛋白酶，用22.2 ml的滅菌水溶解于50 ml離心管，密封試管，置于37℃水浴45 min，輕柔震蕩，制得濃度為45 mg/ml的鏈霉蛋白酶，分裝置于超低溫冰箱保存備用。
1.3.2乙醇溶液制備 分別量取乙醇0.2、0.4、0.8 ml，均使用系統水定容至20 ml，制得濃度（v/v%）為1.0%、2.0%、4.0%的乙醇溶液。
1.3.3白藜蘆醇溶液制備 電子天平稱取白藜蘆醇粉末0.030 g，使用系統水定容至1 L，制得濃度為0.03 g/L的白藜蘆醇溶液。
1.4儀器
電子天平：德國Sartorius公司；隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；體視顯微鏡：德國Zeiss公司；斑馬魚行為學分析系統：法國ViewPoint公司；細胞培養TC24孔板（每孔半徑r=8 mm）：上海吉泰遠成生物科技有限公司。
1.5白藜蘆醇預處理
取自然繁殖的0 dPF魚卵若干顆，用鏈霉蛋白酶進行脫膜處理。取成功脫模且狀態良好的魚卵300顆并均分為兩組，即白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇非處理組。白藜蘆醇處理組魚卵使用0.03 g/L的白藜蘆醇溶液從0 dPF養殖到4 dPF，再將0.03 g/L的白藜蘆醇溶液換成系統水，養殖至5 dPF。白藜蘆醇非處理組魚卵使用系統水從0 dPF養殖到5 dPF。
1.6行為學檢測
將幼魚轉移至24孔板中，每孔1條幼魚。向孔中加入1 ml不同濃度的乙醇溶液（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%）。將24孔板放入行為學分析系統箱體中。
1.7開放曠場實驗
斑馬魚幼魚可以在每個孔中自由游動，由箱體內攝像機記錄每個孔中斑馬魚幼魚的游動軌跡。實驗周期設置為40 min，分別是1～25 min處于光照適應期（正常環境）、26～30 min處于光照測試期（正常環境）、31～35 min處于黑暗期、36～40 min光照恢復（正常環境）。光照期：光照強度為100 Lux；黑暗期：光照強度為0 Lux。白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇非處理組各測試3組，所有實驗均在9：00～16：00完成。實驗過程中，實驗室周圍保持安靜，行為學檢測的室溫和水溫均為（28.5±0.5）℃。
1.8統計學處理
采用Viewpoint軟件分析開放曠場實驗的視頻，導出游動距離、平均游動速度、游動時間等運動參數，30 s/次，并輸出相關數據。主要分析第26～30分鐘光照w行分析，數據比較采用雙因素方差分析和Sidak分析，統計學檢驗水平設為0.05，以P
2結果
2.1早期白藜蘆醇處理對急性乙醇作用下斑馬魚幼魚自發運動的影響
2.1.1光照期 雙因素方差分析顯示，F乙醇=45.96，P乙醇
2.1.2黑暗期 雙因素方差分析顯示，F乙醇=21.14，P乙醇
2.2早期白藜蘆醇處理對急性乙醇作用下斑馬魚幼魚對光照變化應激的影響
在2.0%乙醇作用下，白藜蘆醇處理組和非處理組的光照游動距離與黑暗游動距離比值均顯著增加（P均
3討論
Karlsson等[12]給予小鼠不同濃度的乙醇，通過行為學測定發現低濃度乙醇能促進小鼠的自發活動水平，高濃度乙醇則出現自發活動水平被抑制的現象，這與成年斑馬魚對乙醇的反應基本一致，即在較低濃度乙醇的急性處理下表現出自發運動的增強，隨著乙醇濃度的逐漸增高表現出運動的抑制，同時失去了對環境中刺激因素的反應[5]。本研究結果顯示，在光照環境中給予斑馬魚幼魚乙醇刺激，其自發活動水平隨著乙醇濃度的增高而增加，這一現象與本研究的實驗對象有關。5 dPF的斑馬魚幼魚已經可以出現神經系統反應[6]，但與成魚相比較，神經系統并未發育完全，對乙醇濃度的敏感性較低[7]，所以會產生2.0%乙醇作用的斑馬魚幼魚在光照環境下自發運動水平上升的現象。
Emran等[13]的研究顯示，在斑馬魚幼魚發育到4 pPF時，野生型斑馬魚幼魚對光線的刺激已經有相應的反應，即無論是光線突然從明亮變黑暗還是光線突然從黑暗變明亮，斑馬魚幼魚都會出現驚嚇反應，因此，當光線由明轉暗時，斑馬魚幼魚會出現游動的增加，這與光線變化所導致的應激作用相關。由于斑馬魚在黑暗中游動多，在光亮中游動少，因此光亮中游動距離與黑暗中游動距離的比值一般1，提示在高濃度乙醇作用下，斑馬魚幼魚的應激反應已基本消失。
Liu等[14]的研究發現，白藜蘆醇干預可以通過其良好的抗氧化作用緩解小鼠慢性溫和應激導致的抑郁癥狀，從而提高小鼠的自發活動水平。本研究中，在中低濃度乙醇的作用下，白藜蘆醇處理組的游動距離比值均高于非處理組，說明白藜蘆醇預處理可以降低斑馬魚幼魚因乙醇誘導的應激反應增加。Hu等[15]的研究顯示，白藜蘆醇可以緩解腦內因可卡因戒斷導致的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）上升；而在高濃度乙醇作用下，白藜蘆醇處理組對應激反應消失的作用并不明顯，這可能與預處理的白藜蘆醇濃度有關。斑馬魚幼魚的給藥方式主要通過皮膚吸收，因此斑馬魚生活的水環境是唯一的給藥介質，而白藜蘆醇作為天然單體化合物，其在水中溶解度較低，僅為0.03 g/L。本研究選擇該濃度為干預濃度，已發現其對乙醇造成的行為異常有一定的緩解作用，在進一步的研究中可嘗試提高白藜蘆醇的給藥濃度，從而進一步探索白藜蘆醇對神經損傷的具體緩解途徑。
本研究中，在相同濃度乙醇的情況下，白藜蘆醇處理組的斑馬魚幼魚游動距離均多于非白藜蘆醇處理組，但差異無統計學意義。Pal等[16]在白藜蘆醇對氟化物誘導的基因損傷的作用研究中發現，白藜蘆醇干預后腦內多巴胺含量顯著增加，這說明白藜蘆醇可能會通過增加多巴胺含量來增加斑馬魚幼魚的自發游動水平。在柳富平等[17]對多巴胺和運動能力的研究中也驗證了多巴胺含量增加可以提高運動能力這一觀點。
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[關鍵詞] 白藜蘆醇；椎間盤突出；盤髓核細胞；細胞因子
[中圖分類號] R9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）08（c）-0057-02
腰椎間盤突出是一種慢性退行性疾病，其確切病因和病理生理機制仍不清楚[1]。目前，炎癥因素在椎間盤退變中的作用日益受到關注[2]。參與椎間盤突出的炎癥介質有很多，包括IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2等[3]。IL-1β可以促使內皮細胞產生多種生物活性物質，還可以激活腦內的多種酶，如COX-2、iNOS等[4]。因此，以IL-1β作為炎癥反應的誘導物，可廣泛應用于各種細胞模型當中。該實驗旨在探討白藜蘆醇對IL-1β誘導椎間盤細胞分泌細胞因子的影響，為研究椎間盤退行性病變的防治提供理論依據。現報道如下。
1 資料與方法
1.1 主要實驗試劑
白藜蘆醇購自Sigma-Adrich公司（純度>99%）。用DMSO配制成 0.2 mol/L 母液備用，使用前DMSO終濃度不高 0.1 %。IL-6和IL-8購自深圳欣博盛生物科技有限公司。IL-1β購自Sigma-Adrich。細胞培養板購自Corning。
1.2 髓核細胞的原代培養
將椎間盤手術患者術體內獲取的椎間盤組織用D-Hanks液清洗，并將髓核組織與纖維環及纖維環交界區組織剪成1 mm3的小塊， 反復洗滌后加入0.25%的胰蛋白酶消化15 min。離心洗滌后繼續用0.2% II型膠原酶消化4 h。用完全培養基終止消化并用200目尼龍網過濾后，吹打成細胞懸液后接種于6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養。
1.3 實驗分組與處理
待髓核細胞生長至融合度為90%左右時，根據不同的實驗目的分為組：①空白對照組：僅加入0.1% DMSO；②IL-1β組（陽性對照組）：加入5 ng/mL IL-1β作用2 h；③Res組：加入終濃度為5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L 3種濃度，按不同的實驗目的分別作用 0 h、12 h、24 h、36或48 h。培養中止后收集細胞，進行測定。
1.4 ELISA檢測IL-8和IL-6的產生
收集感染后24孔板中細胞上清液，按照ELASA 試劑盒說明書檢測IL-8、IL-6的水平。即，100 μL細胞上清液加入到每個捕獲抗體包被的微孔板中，室溫孵育2 h。洗板后，加入100 μL檢測抗體，室溫繼續孵育2 h。隨后棄混合物，每孔加入100 μL streptavidin-HRP，室溫避光孵育20 min。最后，每孔加入100 μL底物，室溫避光孵育20 min，然后加入50 μL終止液，分光光度計檢測450 nm處OD值。
1.5 統計方法
采用SPSS 15.0統計學軟件處理數據，結果采用均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用one-way方差分析并行Student’s t檢驗。
2 結果
2.1 髓核細胞的分離與培養
人椎間盤髓核組織培養后4 h，細胞尚未完全貼壁，形態學表現為圓形，胞漿比例較大，細胞核清亮。繼續培養5～7 d后，髓核細胞開始貼壁并轉化為梭形原代細胞且呈單層生長。隨后細胞間開始有突起相連接。15～20 d后融合成片。
2.2 不同濃度白藜蘆醇對IL-1β誘導髓核細胞產生IL-6和IL-8的影響
髓核細胞未經任何處理情況下，產生的IL-6和IL-8較低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8產生顯著增多。而細胞隨后用5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜蘆醇處理后，IL-6和IL-8含量隨著白藜蘆醇濃度的遞增而逐漸降低。見圖1。
2.3 白藜蘆醇不同時間對IL-1β誘導髓核細胞產生IL-6和IL-8的影響
髓核細胞用5 ng/mL IL-1β作用12 h即可誘導較高水平的IL-6和IL-8表達。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜蘆醇作用后，IL-8和IL-8水平明顯低于IL-1β組。見圖2。
3 討論
隨著對炎性因子的深入研究，發現其不僅在導致疼痛的過程中發揮重要作用，而且還參與了椎間盤的退變。IL-6是一種具有許多生物學功能的細胞因子，對多種細胞的生長、化及基因表達都有影響，在椎間盤退行性病變中起重要作用[5]。研究顯示，突出腰椎間盤組織培養液中IL-6含量遠遠高于正常椎間盤組織.腰椎間盤中的IL-6可能是通過自分泌或旁分泌方式產生，并作用于椎間盤自身細胞從而產生一系列病理效應。和IL-6一樣，IL-8作為重要的白細胞趨化因子，對特異和非特異的免疫反應細胞具有強烈的趨化作用，并能調節細胞同血管內皮細胞的粘附和相互作用[6]。目前發現IL-8是多種原因所致的缺血再灌注損傷過程和全身性失控炎癥反應的主要炎癥因子，同時也可能參與椎間盤組織的退變[7]。
該實驗的研究結果顯示，單純的髓核細胞本身分泌IL-6和IL-8不多。給予IL-1β刺激后，其含量顯著增高。而給予白藜蘆醇預處理后，髓核細胞中IL-6和IL-8含量隨著白藜蘆醇濃度的增高而明顯降低，這表明白藜蘆醇落能夠抑制退變椎間盤組織中IL-6和IL-8的異常表達，對阻止頸椎間盤退變具有良好作用。白藜蘆醇通過阻止退變頸椎間盤炎性因子的滲出，從而阻斷了炎性因子對頸椎體的破壞作用，但究竟其影響機制如何，尚需進一步研究。
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【摘要】 目的 探討白藜蘆醇（Resveratrol，Res）體外抑制U251、U87和SHG44腦膠質瘤細胞生長及誘導凋亡的不同作用比較，驗證Res確可導致U251細胞凋亡。方法 MTT比色法測量不同劑量的Res作用U251、U87和SHG44膠質瘤細胞24h后對增殖的影響及不同劑量的Res作用U251、U87和SHG44細胞6h、24h、48h后的影響。流式細胞儀用Annexin VFITC和PI雙染檢測U251、U87和SHG44細胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342熒光染色、透射電鏡(TEM)觀察U251細胞形態改變，流式細胞儀測定U251細胞的細胞周期改變。結果 Res明顯抑制U251、U87和SHG44細胞的生長和增殖（P＜0.01）且對U87細胞的抑制作用最強，U251和SHG44細胞次之；對U251細胞的抑制作用呈濃度及時間依賴性反應；Res所致的U251 、U87和SHG44膠質瘤細胞凋亡為濃度依賴關系，且對U87細胞的凋亡作用強于U251和SHG44細胞。U251凋亡細胞的細胞周期主要發生G1期阻滯。結論 Res對U251、U87和SHG44細胞生長抑制及凋亡作用以U87細胞更明顯，對U251細胞的抑制作用呈濃度及時間依賴性反應并引起了其細胞周期改變。
【關鍵詞】 白藜蘆醇；膠質細胞瘤；細胞凋亡
Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing Apoptosis
Key words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis
0 引言
Res是一種多酚類化合物，化學名為3，5，4’三羥基反均二苯代乙烯(3，5，4’trihydroxystilbene， C14H12O3)，分子量228.2 [1]。近年來對其抗腫瘤作用研究較廣泛。本研究旨在證明Res可抑制人源腦膠質瘤細胞系U251生長并導致其發生凋亡及細胞周期改變，探討生長抑制與劑量、時間及凋亡與劑量的關系，并與Res抑制U87及SHG44腦膠質瘤細胞生長及誘導凋亡的作用比較。
1 材料與方法
1.1 材料
Res購自Sigma公司，用DMSO溶解配成200 mmol/L貯存液-20℃凍存備用；U251、U87和SHG44細胞系由本研究所提供；DMEM培養基購自Gibico公司；胎牛血清購自灝洋生物公司；MTT、Hoechst 33342熒光試劑盒、Annexin VFITC和PI均為Sigma公司產品。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
U251、U87和SHG44細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。
1.2.2 MTT法
實驗首先進行3種細胞Res處理24h的生長狀態比較，取對數生長期U251、U87和SHG44細胞，接種至96孔板內；實驗按3種細胞分3組，每組將Res分7個不同濃度梯度，分別為5、25、50、100、200、300、400μmol／L的處理組及濃度為0μmol／L Res 的等量DMSO的對照組，每種濃度設6個重復孔，并以空白孔調零。各組細胞培養24h后，將培養液換成含不同濃度Res的培養液，繼續培養24h，隨后每孔加入20μl、5g/L的MTT，繼續培養4h，最后每孔加150μl DMSO振蕩10min，酶標分析儀檢測490nm波長的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同樣方法進行Res處理U251、U87和SHG44細胞6h、24h、48h的分組及其細胞生長狀態的MTT法OD值測量。所得數據用SPSS 10.0軟件計算均數及標準差，并進行方差分析，組間差異采用Dunnettt 檢驗。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期及Annexin VFITC 和 PI雙染檢測細胞凋亡率
消化收集200μmol/L Res處理24h的U251細胞及對照組細胞，調整細胞濃度1×106 /ml各取4ml，按常規細胞周期樣品檢測方法作程序性處理后進行流式細胞儀檢測；分別消化收集300、150、50、5μmol/L Res處理24h組的U251、U87和SHG44細胞和DMSO對照組的細胞，加入5μl Annexin VFITC和5μl PI于細胞懸液中避光染色10min，流式細胞儀檢測凋亡的百分比，數據用multicycle分析軟件處理。
1.2.4 凋亡細胞的光鏡觀察
將U251傳代細胞接種于蓋玻片表面，培養24h后，換成含200μmol/L Res的DMEM培養液，繼續培養24h后，HE染色，光鏡觀察。
1.2.5 凋亡細胞的Hoechst 33342熒光檢測
200μmol/L Res處理24h的U251細胞按熒光染色試劑盒方法逐步進行后熒光顯微鏡下攝片。
1.2.6 凋亡細胞的TEM觀察
消化收集200μmol/L Res處理24h的U251細胞，細胞計數1×106 ～107，1 500r/min離心15min后，4%戊二醛固定，按常規TEM樣品作程序性處理，行TEM觀察。
1.3 統計學分析
采用SPSS10.0統計軟件進行分析，計量資料結果采用(±s)表示，組間均數的比較用t 檢驗分析和方差分析。
2 結果
2.1 Res所致U251、U87和SHG44細胞的細胞毒性效應比較
通過設計的MTT實驗，首先比較了Res對U251、U87和SHG44細胞生長的抑制效果，見圖1。隨著Res作用濃度的增加、作用時間的延長，膠質瘤細胞受抑制作用越顯著，從左到右的生長曲線分別為U87、U251和SHG44細胞，可以看到U87細胞在同種濃度下的受到抑制更明顯，存活率更低；MTT法分析存活率，當前存活率=同一濃度處理組OD值均值/DMSO對照組OD值均值×100%，設DMSO對照組存活率為100%。
其次Res作用6h、24h、48h后的U251、U87和SHG44細胞的存活率見圖2，Res引起的3種膠質瘤細胞生長抑制作用有濃度和時間的依賴關系，且有顯著差異（P＜0.01）。
2.2 Res導致細胞凋亡的流式細胞儀分析
經300μmol/L、150μmol/L、50μmol/L Res處理24h后和DMSO對照組的U87、SHG44和U251細胞的凋亡率（包括早期及晚期凋亡）分別為52.2%、38.6%、24.4%、2.3%、40.5%、34.4%、22.7%、2.5%、43.8%、37.1%、23.3%、2.1%，有濃度依賴關系。3種細胞的凋亡率比較，可見不同濃度的Res作用后的凋亡率U87＞U251＞SHG44，與MTT法測得的抑制率結果相一致。DMSO對照組及150μmol／L Res處理組的U251膠質瘤細胞的凋亡分布圖，見圖3A、B。U251的細胞周期改變， G1、G2、S期的細胞對照組分別占69.5%、2.7%、27.8%，200μmol/L Res處理組分別占76.4%、2.2%、21.4%。G1期比例升高，S、G2期比例降低，見圖3C、D。
2.3 形態學結果
2.3.1 HE染色
光鏡下觀察所見U251凋亡細胞，細胞變圓、細胞核固縮、深染，核染色質致密，形狀不一、大小不等的團塊邊集于核膜。
2.3.2 Hoechest 33342染色
U251凋亡細胞的熒光染色高倍鏡下觀察結果，可見凋亡細胞，細胞核固縮，核染色質邊集，熒光信號強，見圖4。
2.3.3 透射電鏡觀察
凋亡的U251細胞表面絨毛消失，表面光滑，細胞膜表面有出泡現象，線粒體崩解，胞質濃縮，染色質晚期碎裂，邊集。
3 討論
Res是普遍存在于葡萄屬植物中的一種物質，是一種多酚類化合物，已在72種植物中被發現。對Res藥理作用的認識最早源自其具有抗脂質過氧化作用。近年對Res抗腫瘤活性機制的研究揭示，其在腫瘤啟動、促進及發展3個階段都有抗腫瘤功效。目前提出的Res抗腫瘤途徑有很多種，但機制還不是很清楚。本實驗證實Res對U251腫瘤細胞的抑制率大于凋亡率更大于死亡率，說明Res導致凋亡作用不是唯一途徑。我們主要對Res導致U251細胞凋亡及引起其細胞周期改變進行研究，證實Res阻滯U251膠質瘤細胞的細胞周期從G0/G1期進入S期，導致了S期減少，并且根據文獻報道Res可通過抑制人腦膠質瘤U251細胞 [2]、人乳腺癌MCF7細胞 [3]的細胞周期蛋白cyclin D1表達，導致細胞周期G0/G1阻滯，并應用周期素依賴性蛋白激酶抑制劑可以抑制Res導致的凋亡 [2]，由此考慮細胞周期的阻滯可能促進了Res導致的凋亡性死亡，引起了腫瘤細胞生長抑制，但是其確切的作用機制還有待我們深入的研究。
本研究證明Res對U251膠質瘤細胞的生長抑制呈濃度和時間依賴關系，這與我們以前對SHG44 [4]、U87 [5]細胞的實驗結果一致，也與文獻對RT2膠質瘤 [6]、乳腺癌 [3]、前列腺癌 [7]等的報道結果一致。同時，我們也證明了Res對人源U251、U87和SHG44膠質瘤細胞產生明顯的凋亡作用，與其引起其他腫瘤細胞發生凋亡 [6，8]的結果有相似性，都有濃度依賴關系。本實驗又證實Res對U251、U87和SHG44細胞生長抑制及凋亡作用以U87細胞最明顯，這樣我們以后可以采用更為敏感的U87細胞進行機制研究及動物實驗。另外，實驗中用于溶解Res的溶劑為稀釋至1‰的DMSO溶液，對細胞不具有毒性作用，Res對正常細胞及3T3成纖維細胞沒有明顯毒性作用 [6，8]。
以上實驗證明了Res確可抑制人源U251膠質瘤細胞增殖并誘導凋亡，并篩選出了對Res更為敏感的U87細胞作為以后機制研究的細胞系。我們認為加強Res的抗癌耙點研究，可以為臨床開發新藥物提供理論依據。同時我們認為Res作為一種天然藥物比傳統化療藥物有優勢，有著很好的應用前景。（本文圖4見第318頁）
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[關鍵詞]色譜法；葡萄酒；白藜蘆醇
中圖分類號：V750 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2017）16-0348-01
中草藥在國家已經擁有數千年的歷史，屬于民族的瑰寶，但是仍需要經過大量的研究推動中藥產業的進一步發展。白藜蘆醇的化學分子式是C14H12O3，是非黃酮類多酚化合物，其相對分子質量是228.25，這是葡萄酒中的重要組成部分，因此有益于人體的健康。野生刺葡萄中的白藜蘆醇含量很高，同時這樣的物質還具有良好的抗癌抗菌效能，發揮出優質的藥理作用，受到了國內外學者的廣泛關注。白藜蘆醇的化學結構具備反式和順式兩種構象，在自然界中的白藜蘆醇主要是以反式構象為標準，這兩種構象能夠在一定條件下實現相互的轉化，例如反式構象白藜蘆醇經過紫外光照射之后可以及時轉化為順式異構體，這種順式異構體的化學構象如圖1所示。高效液相色譜技術就是在液相和氣相色譜法發展的基礎上，誕生出的具有分離和檢測能力的技術，發揮出簡便、快速、靈敏的特點，推動了這項技術的應用與發展，逐漸在生物工程、食品監測、醫療制藥等多種領域投入使用。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
1.1.1 儀器
Agilent1100系列的高效液相色譜儀器的色譜柱全部是從美國安捷倫科學技術公司引進，MILLI-Q超純水純化系統主要是從美國的Millipore公司引進，CSF-3A超聲洗清器是從上海的超聲波儀器廠購進。
1.1.2 試劑
白藜蘆醇對照品、甲醇、冰醋酸、雙蒸水、Triton X-100、氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、葡萄酒。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
1.2.1.1 白藜蘆醇對照品的配制
稱取50g的白藜蘆醇對照品，然后適當的加入100毫升的甲醇溶液，經過配制成500毫克每毫升的標準儲備液，然后運用百分之五十的甲醇溶液和標準的儲備液不同比例進行混合，配制為不同濃度的對照品溶液。
1.2.1.2 葡萄酒中白藜蘆醇的提取
量取五百毫升的干紅葡萄酒，適當的加入五百毫升的乙酸乙酯溶液，經過充分的振動，使其完全的融合，經過靜置待其分層，把有機相旋轉40攝氏度之后蒸發干，殘留物應該加入甲醇溶液定容到100毫升溶解萃取之后避光進行保存，上機測定之前還應該超過0.45微秒濾膜去除相應的雜質，獲取供試品溶液。
1.2.2 色譜條件
順式白藜蘆醇檢測波長應該保持在305納米，反式白藜蘆醇的檢測波長應該保持在320納米，柱溫控制在35攝氏度，流動相是甲醇和百分之一乙酸按照體積比值35：65配制，流速是1.0毫升每分鐘，進樣量是20微升。
1.2.3 平衡溫度的影響
白藜蘆醇需要在55攝氏度的平衡溫度下才能獲取到最好的萃取率，并且也能夠獲得最好的峰形，如果溫度進一步升高，峰形可能會變得不對稱，出現越來越寬的趨勢，所以在實驗中，應該選擇55攝氏度作為平衡溫度。
1.2.4 系統適應性試驗
1.2.4.1 線性關系
通過量取濃度是500mg/ml的標準儲備液和百分之五十的甲醇溶液配制出不同濃度對照品，濃度分別是0.2500、0.1250、0.0250、0.0125、0.0025mg/ml。通過明確量取配制好的不同濃度的對照品溶液20微升，測定出峰面積，通過進樣濃度X和峰面積Y設置線性回歸，由此得出相應的回歸方程。
1.2.4.2 精密度試驗
量取1.2.1.2中的供試品溶液20微升，在經歷了五次的重復進樣之后，測定出白藜蘆醇的峰面積，計算出相應的標準偏差。
1.2.4.3 穩定性試驗
通過量取供試品溶液的20微升，在間隔一小時測定一次之后，總計的進樣是24次，在此之后測定出白藜蘆醇的峰面積，計算出標準偏差。
1.2.4.4 重復性試驗
量取供試品溶液共計五份，測定出白藜蘆醇的峰面積，計算出具體的標準偏差。
1.3 數據分析
運用Markerlynx ApplicationManager Version件加以分析，把保留時間范圍和偏差設置在1-30分鐘、2秒，相對分子的質量范圍和偏差分別設置為50-1000及50ppm，把最小強度設置為50。
2 結果
2.1 線性關系
所獲得的回歸方程是Y=9096.6X+13.806，r=0.9998（n=5）。通過分析相應的結果，可以發現白藜蘆醇的濃度保持在2.50-255.00μg/m L時，和峰面積始終呈現出良好的線性關系。
2.2 精密度試驗結果
供試品的峰面積相對標準偏差是0.76%。
2.3 穩定性試驗結果
供試品的峰面積相對標準偏差是0.95%，表明了在二十四小時內穩定。
2.4 重復性試驗結果
供試品峰面積的相對標準差是0.77%，證明了此測試的重復性較好。
3 討論
中藥屬于一種相對復雜且未知的物質體系，因此其化合物的種類較多，數目不明確，不同的方劑含量差異較大，體現出復雜性。白藜蘆醇廣泛的存在于葡萄、百合與豆科植物中，體現出抗病毒的功效，因此被廣泛的應用至心腦血管疾病的預防中。正是因為白藜蘆醇在食品和醫藥方面發揮出的良好功效，讓相應的研究人員更加關注。為了解決白藜蘆醇中藥現代化的問題，需要讓中藥得到國際的認可，因此才能有針對性的開展工作，通過運用合理的新方法解決新問題。高效液相色譜分離分析法在面對中藥復雜的構成成分時，可以及時快速的完成分離純化的工作，做到省時、高效、低耗的落實，并且能夠有效的提供最佳液相色譜，二維分離方式明顯的減少了離子的抑制效應，從而獲取到更多的樣品化合物信息，為更好的分析中藥提供了較為廣闊的平臺。
此次研究主要是通過高效液相色譜分離分析法在葡萄酒萃取白藜蘆醇的實驗，體現出極好的精密度、穩定性和重復性，驗證了高效液相色譜分離分析法已經成為了當前中藥復雜體系研究中的重要技術，因此可以為復雜體系中藥分離分析提供可靠的保障。
綜上所述，白藜蘆醇的濃度應該在2.50-255.00μg/mL的時候和峰面積呈現出最佳的線性關系，其中體現出的精密度、穩定性和重復性的標準偏差都在0.76%以上。由此判斷，高效液相色譜分離分析法在葡萄酒萃取白藜蘆醇中的應用效果顯著，體現出廣闊的發展前景。
參考文獻
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關鍵詞：肝癌；Ras相關區域家族1A；甲基化
肝細胞癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一[1， 2]。近年來DNA甲基化在肝癌的發病過程中日益受到重視，在DNA甲基轉移酶（DNMTs）的作用下，胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶（CpG）[3]。DNA異常甲基化可導致多種癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，與多種腫瘤的發生密切相關[4]。藜蘆醇是廣泛存在于各類植物中的一種天然多酚，研究顯示其具有多重藥理作用，包括心肌保護，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒張等。此外，白藜蘆醇也能通過多種機制調節腫瘤細胞的增殖，侵襲以及凋亡，因此是一種潛在的高效腫瘤預防藥物[5]。但其對肝癌細胞具有何種作用仍然不清楚。本研究旨在觀察Rev能否影響肝癌HepG2細胞系中RASSF1A基因的表達和甲基化，以此為腫瘤肝癌的預防提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
白藜蘆醇（純度98%）為sigma產品；RASSF1A引物和其亞硫酸氫鹽轉化啟動子區購于Integrated DNA Technology. M. SssI 甲基酶、S-腺蛋氨酸（3.2mmol/L）、10×保溫緩沖液購于New England Biolab Inc，其余分析純試劑主要購自生海生物工程有限公司。
1.2 細胞培養與活性研究
人肝癌細胞系HepG2用含10%牛胎兒血清、100U/mL的青霉素以及100U/ml的鏈霉素的DMEM培養基（pH7.4）中在37℃、5% CO2條件下培養。實驗前將細胞密度調整至105/mL。實驗分為陰性對照組和白藜蘆醇處理組。其中對照組加入等量的DMEM培養基（含終濃度低于0.1%的DMSO）。處理組加入不同濃度的白藜蘆醇在37℃下處理實驗細胞24～72h。隨后用于MTT分析，并計算抑制率。抑制率=（對照組OD值-實驗室OD值）/對照組OD值×100%。
1.3 Western blot與甲基化活性分析
細胞處理完畢后，離心（
1.4 DNA提取和水解
獲取1×107個Rev處理后的HepG2細胞，按照DNeasy Tissue kit （Qiagen）試劑盒操作步驟提取基因組DNA用于全細胞甲基化分析。DNA水解方法根據參考文獻提供的方法進行[6]。
1.5 高效液相色譜- 電噴霧質譜檢測
液相色譜包括HPLC 系統，色譜柱和預柱。流動相為0.1%甲酸-甲醇，流速為0.2 mL/min。電噴霧離子模式為正離子，掃描范圍為m/z 100～2 000， 離子源溫度450℃， 噴霧電壓為415 kV，破簇電壓為55 V，入口電壓6 V。采用Sciex Analyst software軟件處理數據。
2 結 果
2.1 Rev增加HepG2細胞RASSF1A mRNA和蛋白表達
如圖1所示，HepG2細胞基礎狀態下RASSF1A表達水平較低，而經10 μmol/L 和30 μmol/L Rev處理后，能顯著增強RASSF1A蛋白的表達。
圖1. Rev對HepG2細胞RASSF1A mRNA和蛋白表達的影響
1.對照組；2.10 μmol/L Rev；3.30 μmol/L Rev
2.2 Rev能降低RASSF1A啟動子區域以及全基因組和細核DNA甲基化以及DNMT1表達水平
高效液相色譜- 電噴霧質譜結果顯示，30 μmol/L Rev處理HepG2細胞后，與對照組相比， RASSF1A啟動子甲基化水平降低至32%，全基因組甲基化水平降低44%，與對照組相比，差異有統計學意義（P
2.3 Rev對肝癌細胞增殖的影響
HepG2細胞經Rev處理后，其增殖活性收到一定程度的抑制。其中10和30 μmol/L Rev作用后，細胞存活率降至36%和24%（P
3 討 論
有證據表明Rev可能是肝癌的一種有效的預防和治療劑。但是，Rev發揮作用的分子機制仍然不清楚。本研究中，我們首次證實Rev能上調肝癌細胞中因甲基化而失活的RASSF1A基因 mRNA和蛋白的表達。同時，RASSF1A的激活還與降低其啟動子甲基化有關。此外，本研究也發現Rev對HepG2細胞增殖具有抑制作用。因此，Rev可能通過抑制DNA甲基化，從而抑制肝癌生長增殖。本研究發現Rev能在一定程度上抑制DNMT1的表達，從而通過降低RASSF1A啟動子甲基化從而重新激活RASSF1A，這可能是其化學預防肝癌的一種新的分子機制。一些超甲基化沉默的抑癌基因，如GSTP1和MGMT，已經被認為在肝癌和其他癌細胞系中被外源性因素重新激活。這說明Rev能誘導DNA去甲基化以及重新激活由此沉默的抑癌基因。
盡管白藜蘆醇具有多方面的正向生物學效應，但其在體內的轉運和分布仍不清楚，由于它水溶性很低，因此白藜蘆醇必須與相關蛋白結合后才能在血清中保持較高的濃度[7]。此外，對于治療性的藥物而言，其與轉運蛋白的結合能力直接決定了其療效。因此對于臨床肝癌的治療，其制作工藝還有待進一步完善以提高其藥理動力學效應。
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1.廈門市第三醫院神經內科，福建廈門 361100； 2.遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義 563003
[摘要] 目的 探討反式白藜蘆醇（TR，Trans-Resveratrol）對Aβ25-35損傷大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A亞基表達的影響。方法 選擇經莫式水迷宮(MWM)訓練合格的大鼠，隨機分為6組：假手術組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對照組。模型組通過在大鼠海馬內注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎上分別用TR高、中、低劑量TR干預獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時用安理申干預獲得安理申對照組，每組6只，采用實時聚合酶鏈反應法(real time PCR)檢測6組大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A表達。 結果 在MWM中模型組逃避潛伏期比TR高、中、低劑量組、安理申組和假手術組明顯延長，各組NMDA受體NR1表達分別為(0.14±0.04), (1.51±0.54), (0.22±0.06), (0.37±0.08,0.61) ± 0.15)(LOW)，(0.97±0.16)(安理申)。各組NMDA受體NR2A表達分別為(0.12±0.07)、(1.72±0.34)、(0.16±0.06)、(0.21±0.08)、(0.52±0.15)、(0.67±0.16)。結論 TR可能有下調海馬NMDAR1 、NMDAR2A受體表達，從而減少海馬細胞凋亡的作用。
關鍵詞 反式白藜蘆醇；癡呆；大鼠；NMDA受體
[中圖分類號] R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）09（c）－0011-03
海馬是學習記憶的重要腦區，是邊緣系統的一個部分[1]。NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長時增強過程，參與調解神經系統的發育，同時在癲癇、腫瘤等多種重要過程中發揮重要作用[2-3]。目前已經發現的NMDA受體多達7種，包括NR1、NR2（A、B、C和D4種）、NR3（A、B2種），NR2各亞單位之間具有很好的相似性，一般將其分為2種亞群[4]。研究表明，反式白藜蘆醇(Trans-Resveratrol, TR)具有一定的抗氧化作用，在防止高血壓、動脈硬化及提高機體免疫力方面有較好的效果[5]。
研究發現，利用基因敲除技術敲除NR1基因后，小鼠CA1區NMDA受體興奮性突觸后電位消失，癡呆大鼠的海馬突觸傳遞發生改變，其海馬的NR2A表達輕度上調，NR1表達明顯上調。經TR干預后海馬及附近腦組織NR1、NR2A表達均下調[9]。因此，我們使用顱鉆鉆孔微注棒Aβ25-35注射損傷雙側大鼠海馬[7-8] ,注射TR后，觀察其對癡呆大鼠保護的效果，并檢測NMDA受體NR1、NR2A的表達情況，以探求臨床上癡呆病人理想藥物治療的實驗研究方法，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
實驗用36只雄性大鼠為本單位實驗動物研究中心提供，體重208~225 g，平均體重215 g。反式白藜蘆醇(TR)粉劑購自西安林禾生物技術有限公司。苦味酸購自生工生物工程（上海）有限公司，鹽酸多奈哌齊（安理申）購自衛材（中國）藥業有限公司，Aβ25-35購自SIGMA公司，逆轉錄試劑、熒光液Green Supermix等PCR試劑購自生工生物工程（上海）有限公司。
1.2 儀器
冷凍離心機（德國5417R）、紫外可見分光光度計（TU-1810）、湘儀 H1650-W離心機，Thermo Piko Real 96 Real-time system實時PCR儀，Bioer XP Cycler普通PCR儀、雙臂腦立體定位儀（68002型RWD life science co）、顱鉆（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宮等。
1.3 動物模型制備
選擇經莫式水迷宮(MWM)訓練合格的大鼠，隨機分為6組：假手術組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對照組。模型組通過在大鼠海馬內注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎上分別用TR高、中、低劑量TR干預獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時用安理申干預獲得安理申對照組。
1.4 NMDA受體NR1、NR2A表達檢測
利用RT-PCR檢測NMDA受體NR1、NR2A的表達，方法參照檢測試劑盒進行，PCR反應條件采用兩步法進行,具體步驟為：95 ℃，3 min； 65 ℃，3 min。
1.5 統計方法
應用spss18.0統計軟件分析所有數據，計量資料以（x±s）表示，組間比較用Levene 檢驗分析。
2 結果
2．1 各組NMDA受體NR1、NR2A表達
各組NRI及NR2A的表達結果見表1，與模型組相比，各組NR1及NR2A的表達差異有統計學意義（P＜0.05），且高劑量組反式白藜蘆醇干預組的NR1的表達明顯減少，與中、低劑量反式白藜蘆醇干預組相比效果好。
2.2 TR各劑量組海馬凋亡細胞病理觀察
TR各劑量組海馬凋亡細胞病理切片結果如圖1所示，TR高劑量組海馬的凋亡細胞數明顯低于TR低劑量組、對照組及模型組，TR低劑量組海馬凋亡細胞數相對對照組及模型組較少。
3 討論
海馬是人類腦部的重要區域，具有調解神經系統的發育的重要作用，是邊緣系統的一個部分，海馬受損是引起阿爾茨海默病的主要病因[6-7]。
NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長時增強過程，研究發現當海馬神經元突觸內NMDA受體被阻斷時，細胞變性死亡將會增加[8-10]。海馬中主要表達的NMDA受體有NR1和NR2A，NR1可以在細胞中單獨表達有功能的同聚受體，但對激動反應很小，NR2A不能單獨形成有功能的通道，只有和NR1組合才能表現活性，并使后者反應明顯加強，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印證的作用[11-13]，研究發現，谷氨酸可能在神經病理變化及癡呆癥狀中起重要作用，在有癡呆的大鼠甘氨酸結合能力降低,提示NMDA受體的功能缺損，Lu等[15]采用免疫印跡法分析AD 患者死后腦NR1下降39% ,NR2B下降40%，提示NMDA受體的功能缺失后, AD患者嗅內皮質中NR1mRNA含量較正常人下降34%，而用用高壓液相色譜分析腦組織標本中的右旋- 天冬氨酸含量發現[16] AD患者的天冬氨酸較相同年齡正常對照組下降，但在神經病理變化較小的小腦中無明顯變化，這些說明右旋-天冬氨酸的降低可能參與NMDA受體功能下調及記憶喪失的過程。Hasanein等[17]則發現AD患者神經受損區具有特異性，Aβ25-35 在AD患者腦內堆集、產生神經毒性可能是通過NMDA受體促進氧自由基的生成所引起的[18]，所以該實驗通過檢測NMDA受體含量變化，推測抗氧化藥物白藜蘆醇是否對癡呆大鼠有作用，結果發現隨著TR劑量的增加，海馬組織NMDA受體的表達減少，癡呆癥狀有所改善，TR對癡呆大鼠海馬起到保護作用，TR對大腦海馬的保護作用可能是通過下調海馬中NMDA受體NR1及N2A的表達完成的，但其具體作用機制還需要進一步研究發現。
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