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關鍵詞:飲料 微生物檢驗 質量控制
近年來,隨著我國市場經濟的飛速發展,飲料行業也取得突飛猛進的發展,各種營養飲料、保健飲料以及各色礦泉水、純凈水等的市場占有率在迅速提高,飲品正成為人們生活中的必需品,飲料質量的問題也接著隨之而來。其質量好壞關系廣大消費者的身體健康。飲料微生物檢驗是飲品安全監測的重要組成部分,我們必須對影響檢驗結果的諸多因素采取控制手段保證檢驗結果的正確性,不斷提高飲品微生物檢驗的質量。
一、檢驗人員素質的控制
飲料中微生物檢驗工作不可能完全由全自動鑒定儀器完成,還需要具有專業知識和豐富經驗的檢驗工作人員通過主觀分析和判斷,才能得出較為客觀的結論,這就要求微生物檢驗人員除具備嚴肅認真的工作態度、精密細致的觀察和操作習慣以外,還必須熟練掌握微生物學檢驗技術和豐富的實踐經驗。
(一)檢驗人員需進行崗前培訓
微生物檢驗人員不但要主動學習、接受培訓、認真聽講座,學習新技術,掌握國家食品衛生微生物學檢驗方法、標準及相關法律法規,而且還要直接參與編寫測試程序及儀器的操作程序,學習質量保證體系知識和計量學基本知識,以提高自身的檢測水平和分析問題、解決問題的能力
(二)注重職業操守
飲品已經成為人們生活的必需品,飲品質量的把關者,微生物檢驗人員的責任重大,如何讓你們放心享用各色飲品,微生物檢驗人員第一要做的就是利用自身的專業知識準確檢驗飲品微生物含量,是否達到國家標準,第二要做的就是,恪守職業道德,嚴把檢驗關,不為不法商販所利用,真正做到權為飲品質量所用,讓人民放心。
二、實驗設備及實驗材料的質量控制
(一)確保儀器設備的準確性
在飲料微生物檢驗工作中,經常會使用各種各樣的儀器設備,它們質量的好壞將會直接影檢驗工作,對高壓滅菌器、干熱滅菌器、培養箱等儀器設備要確保其完好及準確。
首先,保證高壓滅菌器隨時準確使用。操作人員要懂得儀器的工作原理并遵操作規則使用,滅菌物品在放置時不要放得太過擁擠;大氣門排氣或減壓時要緩緩進行,切不可猛然調大或調小,以防容器內的液體沖出瓶外;使用時要有必要的監測指標,一般為121℃、15min;滅菌完畢,待壓力自然降至零時,再關閉電源,開蓋取出滅菌物。
其次,培養箱保持溫度恒定。注意箱內不應放入過熱或過冷的物品,取放物品時,應隨手關閉箱門,以維持恒溫。如培養物灑到箱內,應馬上清潔,并及時消毒。培養物不宜與培養箱最底層直接接觸,以免影響數據的真實性。為保持箱內濕度恒定,可放入裝水得容器保持濕度。每天記錄溫度及濕度的變化,觀察培養箱內溫度與設定溫度是否一致。對兩次記錄進行比對,及時校對儀器。
在實驗室內需要使用的無菌器也應該及時正確地實施滅菌,無菌器具和器皿一般有明顯標識,以便與非無菌器具和器皿加以區別。
(二)嚴格選用培養基
飲料微生物檢驗一般用乳糖膽鹽培養基、四硫磺酸鈉增菌培養基或亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養基等。必須有正規廠家生產,產品質量必須符合有關質量標準,培養基平皿的制備商必須按照標準隨產品附上書面鑒定資料,實驗室應將此鑒定書保存一定時期。實驗室自制培養基應有質量控制,包括制備數量、制備日期、有效日期及制備者名字,培養基顏色、均勻度、厚度、光潔度、溶血與否、有否過多氣泡、是否污染也必須檢查。
培養基的配制應嚴格按照GB4789.28―89規定的方法進行操作,并做好原始記錄。為保證培養基質量,在配制時應注意:制備培養基必須在玻璃容器、搪瓷缸或鋁鍋中進行,如用銅、鐵器皿,會對微生物生長方可使用。配制培養基應有培養基配制記錄。配制培養基一般有毒害作用;配制培養基時應按檢驗項目規定的配方添加,不得隨意增減或更改培養基成分。此外,要用專用的角匙取藥品,避免交叉污染而影響檢驗結果;培養基配制最好用蒸餾水,因為蒸餾水不含有含氯等抗菌物質,更適宜待檢菌株的培養。配制培養基時應測調pH值,不同的菌株各有自身的pH值,調試過程中也可以使用1M NaOH或1M HC1溶液進行調節。
三、飲料微生物檢驗過程的質量控制
檢驗過程是保證檢驗質量的重要關口。針對檢驗過程,我國衛生、商檢等部門都制訂了一系列統一的標準檢驗方法,每個檢驗室根據這些統一的標準方法結合本室的具體條件,分別制定了檢驗工作程序和操作規范,對檢樣的采取、登記編號、記錄要求、檢驗規范、結果報告做了詳細的規定,保證工作正規化、標準化。
(一)規范采集、運送和保存標本
在檢驗飲料微生物過程中,樣品的采集學問很大,首先,要具有代表性,抽樣方案與抽樣工作保持統一,樣品的數量應滿足檢驗、復檢的需要。當樣品送到檢驗室時檢驗人員根據送檢單要求的檢驗項目一一進行核對,驗收樣品的外觀、包裝狀態及樣品有無破損、流失、變質、污染。
其次,必須按照無菌操作要求進行,穿專用的工作服、帽、口罩、拖鞋并應放在無菌室緩沖間,工作前經紫外線消毒后方可使用;進無菌室前用肥皂洗手,然后用75%乙醇棉球消毒后才可以進行檢驗工作。在采樣完成后及時準確貼上標簽,做好記錄。
再次,采集完成后的樣品,保存環境一般在0"C~5"C最為適宜,特殊樣品應特殊保存,冷凍樣品應保持冷凍狀態,并及時送檢。要嚴格按照國家制定德爾標準方法與標準規范進行檢驗,不可隨意的進行操作。
(二)準確記錄實驗數據
檢驗檢測過程中及時準確做好原始記錄,要如實反映檢驗中的重要操作和數據結果。每操作一步得出一組數據,確認后及時記錄,最后對原始數據進行整理,去除不必要的誤差,獲得準確的數據。我們可以采取在檢驗報告中設置空白對照,發現檢驗操作環節中的問題及其原因,以便及時改進。最后在檢驗報告必須要經過復查,消除一些不必要的誤差和低級所悟,但是不得涂改、偽造,需要對數據進行修改,需要報請主要負責人及有關人員簽字后,方可修改。
四、檢驗報告及結果質量控制
對原始數據進行整理、合并、歸納后,用回歸分析法和方差分析法形成檢驗報告。檢驗報告是對上述檢驗工作的一個總結,必須經過規定的手續進行復查,照各類標準對食品衛生的微生物學質量進行全面準確的評價和作出合理的解釋。有關人員簽字后,加蓋檢驗單位印章,以示生效。檢驗結果是需要公布的,所以要慎之又慎,這樣才使檢驗結果既有法律依據又有學術依據。
控制飲料微生物指標主要有菌落總數、大腸菌群、致病菌及霉菌、酵母菌等,每種指標檢測結果的影響因素的區別很大,這就給從事具體檢測工作帶來一定的挑戰性。既要對飲料微生物所處的物理因素、化學因素進行考慮,也要對其所處的生物因素進行通盤監督,不良的環境條件會使微生物的生長受到抑制,甚至導致菌體的死亡。飲料微生物檢驗檢測要按照規定要求操作,這既是實驗的要求,也是對企業、對消費者負責的表現。
參考文獻
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[關鍵詞]微生物檢驗;抗菌藥物;規范化
[中圖分類號]R446.5
[文獻標識碼]B
[文章編號]1006-1959(2009)07-0054-01
2004年8月由國家衛生部等單位了《抗菌藥物臨床應用指導原則》,明確規定診斷為細菌感染者,方有指征應用抗菌藥物,盡早查明感染病原,根據病原種類及細菌耐藥敏感試驗結果選用抗菌藥物。今年3月25日《衛生部辦公廳關于抗菌藥物臨床應用管理有關問題的通知》公布實施。順應合理使用抗菌藥物的需要,微生物實驗室的工作必須加強。
選擇微生物檢驗項目、標本采集和運送方法直接影響標本的檢驗質量。對病原的檢出是確診感染性疾病的主要依據。標本采集與處理不符合要求,則細菌培養的結果毫無意義,甚至使檢驗結果誤導臨床,延誤對患者的正確治療,會造成嚴重后果。微生物檢驗質量控制的主要內容之一,就是對標本采集的規范化。對不同的標本進行微生物培養及采集、運送應嚴格按照醫政司頒布的操作規范進行。
目前從標本采集到給臨床以明確的病原學診斷和抗生素敏感試驗結果費時較長,需要2~3d甚至更長,此時病人的病情已發生了變化,檢驗報告對于治療而言失去了一定的價值。為讓臨床醫師及時了解病原學檢驗情況,要建立微生物檢驗分級報告制度即先報告涂片染色結果,再依次報告培養、鑒定和藥敏結果以及耐藥菌的初篩、確認結果[1]。臨床標本直接涂片檢查對快速診斷或提示某些感染有實用價值,要作為臨床微生物實驗室檢驗常規步驟開展。病原菌的培養檢出,對于感染的確診,抗菌藥物的選用和治療效果有重要意義,結合臨床考慮有特殊病原的可能時(如厭氧菌、結核桿菌、真菌等),應采用特殊培養基提高陽性率。血培養時如病人已接受抗菌藥物治療,培養基內需加入抗生素吸附裝置。痰標本接種3種培養基,即血、巧克力、麥康凱瓊脂培養基。腹瀉病人腸道病原微生物的檢測,根據世界衛生組織(WHO)腹瀉病綱要和我國衛生部臨床檢驗中心有關操作規程進行。日常工作需設計合適的質控頻率進行質控。質控菌株與常規標本一起進行,不能為質控菌株設計單獨操作程序,不能專人專做。質控標準菌株的特性發生改變時要及時更換,在做生化和免疫試驗時一定要設立陰、陽性對照。參加室間質控評比,不斷提高技術水平。及時更新程序性文件,完善實驗室質量保證體系。采用先進技術,做好病原微生物快速檢測和鑒定工作。近年來,病原菌的檢測已向標準化、微量化和快速簡便方面發展,隨著現代分析技術和分子生物學技術的發展,氣相色譜、單克隆抗體、核酸雜交、PCR擴增等技術,已用于病原微生物的快速檢測和鑒定。
食品安全問題是整個社會的大問題,而微生物檢驗問題是食品安全問題中的重中之重,為了提高微生物檢驗結果的準確性和可靠性,就必須建立一套行之有效的質量控制體系。關鍵控制點如下:
一、實驗室的建設和維護
微生物實驗室主要分為無菌實驗室、凈化實驗室、生物安全實驗室等,凈化實驗室應采用封閉過濾除菌通風形式,吊頂、隔墻、圍護全部采用彩鋼板,地面作環氧樹脂自流平處理,并設置非凈化區、更衣區、凈化區。凈化實驗室應定期進行風速監測和及時更換過濾層罩,條件有限的實驗室可使用超凈工作臺;無菌實驗室應配紫外線消毒裝置, 在使用前后都應用紫外線燈照射消毒,并定期進行紫外線強度和空氣質量監測;生物安全實驗室除了正常管理、維護之外,要注意空氣過濾的質量和工作人員的隔離防護。
二、 人員
保證實驗結果的質量,首先應重視檢驗人員的科學技術素質,為技術人員及時了解當今的科技進步信息和掌握先進的實驗技術創造條件。衛生檢驗人員應具有較強的專業知識和技能,應經常參加專業技術培訓交流,以豐富積累工作經驗,提高衛生檢驗的水平。而作為衛生檢驗人員應具有自我監督和自我檢查的質量控制指導思想.在人員的繼續教育方面,微檢人員需受過細菌學檢驗的專門基礎教育,并以細菌檢驗為專業,具有嚴謹的科學工作態度,及時了解和掌握衛生檢驗領域新的進展和動態,并須按照國家衛生檢驗標準來進行操作。
三、培養基、試劑的配置及保存
培養基、試劑的購買,應要求供貨商出具“三證”。培養基和試劑使用前首先通過外觀、批號、PH值、選擇性等進行初步評估, 應檢查培養基和試劑是否合格,是否在保質期內。培養基和試劑的配制應有記錄可查,培養基應按照要求選擇合適的壓力和時間進行滅菌,并且應有高壓滅菌效果的監測記錄。配制的培養基和試劑應進行無菌試驗,并有無菌試驗記錄,并根據檢驗微生物指標不同,應選擇不同的培養基和試劑。基礎培養基不僅要求細菌能生長,還必須發育良好,并能使細菌充分表現出其典型特征;選擇性培養基按不同細菌的生長條件要求而選擇不同的培養基,此外還要選擇不同的陽性對照菌株做質控,以檢驗培養基的質量,如細菌生長、抑制、溶血特征;典型菌落形態、色素等質量情況。配制和傾注培養基時,應注意控制培養基的PH值,因為PH值對細菌的生長影響較大。制好的培養基還應進行無菌試驗,即35℃孵育過夜,看是否有菌生長。不同培養基應按不同培養要求,接種相應菌種,按細菌的生長抑制、形態、色素、溶血環等特征,判斷培養基的質量。培養基和試劑的貯存應按照其說明的貯存條件來保存,不同批號的培養基和試劑不能混合使用。微生物實驗室應配備微檢所需的所有試劑、診斷血清和標準菌株,試劑和診斷血清應注意其有效期,并定期用標準菌株監測其敏感性和特異性,而標準菌株應注意妥善保存,專人保管,并做好菌種領取使用和銷毀的登記制度。各種細菌鑒定用生化培養基,在有效期,應用標準菌株進行質量檢驗。試劑如氧化酶、觸酶試劑,每天用前須以陽性菌株測試,革蘭氏染色液可用金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌作為質控菌。
四、儀器設備
細菌實驗室使用的儀器設備主要有冰箱、培養箱、高壓滅菌器、凈化臺等。對于連續工作的儀器如冰箱、培養箱,每天都要對其進行溫度監控和記錄并定期維護。高壓滅菌器應對其壓力表定期進行檢定,在進行物品滅菌時,應做高壓滅菌效果監測,并且有監測記錄。凈化臺應定期檢測風速, 要求至少每半年監測一次風速,若低于0.36~0.54m/s,則應更換工作臺上方的高效過濾流罩。對于需要溯源的器具如溫度計,應定期進行自校準和檢定,因為控制溫度在整個細菌實驗中很重要的。
五、積極參加室間質量評價活動
質評是質量保證體系的重要組成部分。質量評價是對實驗室作水平和能力的綜合判斷,也是對實驗室內質量控制效果的檢驗。因此,除了做好室內質控的同時,應盡可能參加范圍更廣泛的室間質評活動,以提高衛生檢驗人員的檢驗水平和檢驗結果的準確性。
六、建立一套完整的質量保證體系
1.樣品的管理:樣品應正確采樣,并有充分的代表性,嚴格按照無菌操作要求采樣,且送檢樣品的標志應是唯一性,同時要做好樣品的交接登記保存及處置等工作。送檢樣品盡快檢驗,避免樣品保存時污染、腐敗變質,影響檢驗結果準確性。2.檢驗方法 :微生物檢驗應按國家衛生檢驗標準方法或其他實驗室認可方法進行。3.檢驗過程:檢驗過程中應嚴格執行無菌操作規程,每個樣本要做空白對照和平行樣,以保證微生物檢驗結果的準確性和可比性。4.報告制度:每張報告應有檢驗者、審核者、簽發者的簽名,并附有檢驗原始記錄,以盡量避免錯誤的檢驗報告,保證結果的可靠性和可溯源性。5.完善實驗室管理:建立實驗室內審制度,及時更新程序文件,以不斷提高衛生檢驗管理水平,完善實驗室質量體系。
七、 實驗室的環境
【關鍵詞】細菌 真菌 放線菌 羊草
【中圖分類號】G31 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089(2012)02-0087-02
羊草為禾本科賴草屬植物,又名堿草。它是歐亞大陸草原區東部的重要建群種。羊草是多年生根莖型禾草,對不同生境表現出較強的適應性,對改善我國北方草原生態環境和鹽漬化土地治理具有重大意義。同時,羊草是一種重要的牧草資源,蛋白質含量高,適口性好,耐踐踏,在發展草原畜牧業方面具有現實的經濟和社會意義[1]。羊草作為草原主要牧草資源以及收割干草的重要飼草,是我國東北松嫩草原、內蒙古中東部和西北草原的原始當家品種。但由于長期以來不合理開荒種地、過度放牧和自然災害的影響,使羊草資源受到很大程度的破壞[2]。根際即指植物根周圍數毫米的區域,根際微生物(聚居在根際土壤,以根際分泌物為主要營養的一群微生物)在促進植物生長方面有著積極的作用。本試驗對不同生境羊草根際微生物種群進行了定量及定性分析,現將結果報告如下。
1.研究地區的自然概況與研究方法
1.1研究地區的自然概況
研究地點位于吉林省西部長嶺縣境內。該地區為溫帶季風氣候,冬夏季風更替現象明顯。年平均氣溫4.9℃,最暖月7月平均氣溫為22~25℃,最冷月1月平均氣溫-16~-22℃。年降水量平均為470mm,多集中在6~8月份。年蒸發量為1668mm。該地區地帶性植被為羊草草原,水平地帶性土壤為淡黑鈣土。群落類型以羊草群落占絕對優勢,廣泛分布在低地平原。
1.2研究方法
1.2.1 4月20日羊草返青期開始,按五點取樣法在天然羊草地、人工羊草草地、林邊羊草草地、農田邊羊草草地選取羊草植株,將其根系區土樣用鐵鏟挖出,抖掉根系土,取緊貼在根表附近的土樣。在未種羊草的同一地塊上取土作為對照。采樣深度為0cm~10cm和10cm~20cm兩個層面,按四分法將從各點采集的土樣充分混合均勻,攤平,劃分十字把土分為四份,取對角二份。分別將根系連同根際土壤一同放入無菌袋采回,具體參照文獻。
1.2.2根際微生物的分離培養:細菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養基,放線菌的分離采用高氏一號培養基,真菌的分離采用馬丁氏培養基。自生固氮菌:稀釋平板法,28℃培養7天后計數,阿須貝瓊脂培養基;氨化細菌:MPN法,30℃培養5天后計數,蛋白胨液體培養基;硝化細菌:MPN法,28℃培養10天后計數,改良的斯蒂芬遜液體培養基;纖維素分解菌用Hutchinson培養液MPN法。
1.2.3土壤微生物數量測定:細菌和放線菌的計數采用平板混菌法,真菌計數采用表面涂抹平板法。
1.2.4菌株的鑒定:主要鑒定指標包括菌體形態和菌落特征培養觀察、生理生化指標測定,具體方法參照文獻。
2.結果與分析
2.1羊草根際微生物的類群
(1)細菌。(2)放線菌。(3)真菌。
2.2不同生境根際細菌的數量變化
細菌在不同生境中數量分布大小的順序為:人工草場>林邊>天然草場>鹽堿地。真菌分布順序為:天然草場>人工草場>鹽堿地>林邊。放線菌分布順序為:林邊>天然草場>人工草場>鹽堿地。
不同生境植物群落的種類組成、結構不同,所形成有機質的量和營養成分存在一定差異。微生物主要以植物殘體為營養源,植物的質和量的差異必然導致根際微生物在各植物群落中分布的不均一性。
2.3不同生境根際微生物主要生理群分析
實驗結果表明,根際中自生固氮菌、纖維素分解菌、氨化細菌的數量分布呈現出不均一性。自生固氮菌在不同生境中數量分布大小的順序為:天然草場>林邊>鹽堿地>人工草場。纖維素分解酶分布順序為:鹽堿地>天然草場>林邊>人工草場。硝化細菌分布順序為:人工草場>天然草場>林邊>鹽堿地。氨化細菌分布順序為:林邊>天然草場>人工草場>鹽堿地。
3.討論
植物根際是生物和物理特性受到根系影響的緊密環繞根的區域,在這一區域內,微生物種群豐富,研究和利用這一豐富的微生物資源庫,正不斷受到人們的重視,但國內外對羊草根際微生物的研究卻未見報道。因此研究一定區域內羊草根際微生物數量的變化規律具有一定的現實意義。由于工作量較大,對根際真菌和放線菌的研究,只探討了其數量的變化,未對種群進行鑒定分析,此項工作有待進一步完善。本實驗通過對不同生境羊草根際微生物數量的研究,為進一步研究根際微生物對羊草不同生境生長發育影響和指導羊草生產提供理論依據,也有助于羊草根際微生物生態、微生物肥料等研究工作的開展。
參考文獻:
提高臨床微生物檢驗質量,及時、準確地將檢驗結果回報給臨床醫生,對于感染性疾病的診斷和治療是非常重要的。但目前臨床微生物送檢率和檢驗質量普遍不高,分析其原因,筆者認為以下幾個問題是普遍存在的,應加以注意。
1醫院管理的問題
1.1醫院對微生物室的投入不夠微生物學檢驗較臨床生化檢驗、免疫學檢驗成本高、技術性強、人員素質要求高,醫院對微生物室的軟件、硬件投人不夠,特別是近年心血管、腫瘤等疾病發病率上升,醫院管理者及醫務人員對傳染病的危險性及病原學檢驗的重要性有所忽視。臨床科室開展微生物檢驗項目,專挑一些效益好、操作簡單項目甚至采用給臨床醫師提供“開單費”吸納標本,為獲取局部利益,降低成本、取消室內質控、不參加室間質評。
1.2臨床醫師對臨床微生物學新進展了解甚少臨床醫師不能借助微生物學知識對疾病進行診斷、治療。由于醫師接收大量抗菌藥物信息,用藥前采集標本的原則遵循率低。有些醫師甚至認為細菌培養和藥物敏感試驗限制了自由用藥而加以抵制。
1.3職稱評定受限臨床微生物學工作人員現大多數按技師資格評審職稱,人為地割斷了與臨床密不可分的聯系;某些院校技師職稱無研究生導師資格等,導致有一定臨床經驗同時具有豐富臨床微生物學經驗的人才缺乏,進而導致對新疾病病原缺乏預見性和警惕性,對生物恐怖缺乏足夠的應對能力。
1.4危險崗位工作津貼發放不合理津貼發放,微生物室與檢驗科一樣,低于感染病科和皮膚科的現象普遍存在。
1.5收費方式不合理目前各醫院微生物學檢驗收費方式采用按項目收費,由于標本分離病原菌的不可預知性,陽性標本常因高昂的細菌鑒定及藥敏費用導致賠本,制約了醫院和科室開展工作的積極性。
1.6標本采集、運送過程中的問題標本采集不合要求,采集方法和時間、使用容器不當,標本保存和運送不及時不規范,標本標識不清等。
2檢驗人員的個人素質問題
臨床微生物檢驗具有專業性、技術性以手工操作為主,多依靠形態學和生化反應進行鑒定,每一步驟均需要有效強的判斷能力。雖然也有一些自動化儀器可以利用,但和臨床基礎檢驗、臨床化學、免疫學檢驗等相比,檢驗人員的基礎知識、個人經驗顯得更為重要。因此檢驗人員必須經常閱讀有關資料,不斷地進行專業知識和技術的更新,提高個人專業水平和改進操作技術。檢驗人員都必須接受專門培訓,學習新的專業理論和專業技術,掌握新型儀器的操作使用和維護[1]。細菌室專業人員應保持穩定,。糾正只求檢驗速度,不顧質量的不良作風。
目前存在的另一個問題是檢驗人員和臨床聯系不密切,包括與臨床醫生和與患者之間的聯系,如果檢驗人員能做到隨醫生查房,多了解患者的病情和治療情況,對檢驗方案的設計及得出正確的結果無疑會有很大幫助。
3標本的質量問題
正確采集、運送和處理標本,對提高檢出率是至關重要的。標本采集時間是否恰當采集方法是否正確是整個檢驗的關鍵。如中下呼吸道標本,臨床醫生不但要注意要讓患者在用抗生素前或者停藥24h后來采痰,還要是深部咳痰后第2口痰,并用無菌容器封裝,然后及時送微生物室檢驗;間歇性寒戰或發熱的患者血標本的采集,寒戰或發熱的前后采集也有不同的時間要求,且成人與兒童的血量上也有區別;現在醫院微生物檢驗的標本很多是由臨床醫生或是患者自己采集,特別是糞、尿和痰液標本。采集尿液多用中斷尿采集法,尿標本要取中段尿10~20m,l并要排入無菌容器中;醫生常讓患者不經無菌操作自行收集中斷尿,故常將外尿道的常居菌帶入,造成標本嚴重污染。據研究,經嚴格無菌操作收集的尿液和不經清洗消毒處理,由患者自行收集的尿進行對比測試,往往得出完全不同的結果。對于痰液標本,常由于缺少醫生必要的指導,得到的痰標本常帶有一定量的氣管、咽喉及口腔常居菌,甚至有的根本沒有下呼吸道的成分。正確的方法應該是清晨起床后用涼開水漱口多次,以除去口腔內大量雜菌,用力咳出肺深部的膿痰,置于無菌容器中送檢。
4檢驗方案設計問題
設計合理的檢驗方案對提高檢出率也是至關重要的。如在形態學檢驗中常用的抗酸染色,多數實驗室仍使用齊-尼二氏染色法,而這種方法和熒光染色法相比,陽性率要低10~30倍,尤其對用胺硫脲治療的患者,這是因為胺硫脲能破壞分枝桿菌的抗酸性,而保留其熒光性。據資料介紹,有人用熒光法檢查經多次齊-尼二氏染色法陰性的痰標本,陽性率高達13.5%。再有結核桿菌的直接涂片法和集菌檢查法相比,后者的檢出率明顯高于前者,據調查,目前多數實驗室仍使用直接涂片檢查法。
在培養檢查上,標本的前處理和培養基的選擇很重要。有些臨床標本,如痰、尿等,進行必要的前處理,可除去污染的雜菌,明顯提高陽性檢出率。在培養基選擇上。如疑是淋菌敗血癥患者,選用血培養基應不含多聚茴香腦硫酸鈉(SPS),因(SPS)對淋菌有毒性。為了抑制革蘭陰性菌,分離淋菌所用的培養基一般都加萬古霉素。但據研究,有的地區多達15%的淋菌對培養基中萬古霉素敏感而造成漏檢。再比如,在取糞便分離培養時,常規所用的培養基是伊紅美藍瓊脂和SS瓊脂平板。在這兩種培養基上,致病的腸桿菌科細菌能被選擇出來,但同樣能引起腹瀉的弧菌科有些細菌,如副溶血性弧菌因具有嗜鹽性,在伊紅美藍瓊脂上是不生長的,在SS瓊脂平板上多數也不生長。如果對這類細菌仍用常規培養基分離培養,其結果也是造成漏檢,所以在培養前做培養基性能試驗,對培養基質量進行控制是十分必要的。
筆者認為以上幾方面是臨床微生物檢驗中比較關鍵的問題,實驗后的數據處理、結果報告等方面也是影響微生物檢驗質量的因素。能從上述幾方面注意微生物檢驗質量問題,臨床微生物檢驗的現狀一定會有所改善。
【關鍵詞】 平板菌落計數法;平板放置時間;平板涂布方法
DOI:10.14163/ki.11-5547/r.2016.16.196
平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋, 在規定的條件下培養后, 所得1 ml或1 cm2樣品中含菌落的總數。一般認為, 一個肉眼可見的菌落代表原樣品中的一個單細胞。選擇合適的稀釋度并乘以相應的稀釋倍數就可以獲得樣品中微生物的數量[1]。平板菌落計數法以其重復性好, 能真實地反應樣品中活菌數量的優勢成為我國衛生標準規定的公認可行的方法, 并且在食品藥品研究領域得到廣泛的應用。尤其在醫藥方面, 控制口服制劑中微生物的污染狀況是藥品質量控制的重要指標, 也是評價企業各生產環節衛生狀況的重要手段和依據[2]。另一方面, 平板菌落計數法也可用于檢測活菌制劑類藥物的活菌數量。乳酸菌是食品工業和醫藥行業中被廣泛應用的菌株之一, 其活菌數的多少直接影響產品的質量和功能。因此, 研究乳酸菌的平板菌落計數法的影響因素有助于提高其檢測的準確程度, 進而有效控制藥品制作中微生物數量, 提高產品品質。現將研究結果報告如下。
1 材料與方法
1. 1 材料 MRS液體培養基:蛋白胨5 g, 牛肉膏5 g, 酵母粉5 g, 胰蛋白胨10 g, 吐溫(Tween)-80 1 ml, 葡萄糖20 g, 磷酸氫二鉀2 g, 檸檬酸氫二銨2 g, 乙酸鈉5 g, 硫酸鎂0.5 g, 硫酸錳0.25 g, 蒸餾水定容至1000 ml, 調節pH值至5.8, 121℃滅菌15 min, 用于菌體的活化。MRS固體培養基:MRS液體培養基添加2%(W/V)的瓊脂粉, 121℃滅菌15 min, 用于菌落計數。BCN1360型生物潔凈工作臺;DHP-9082型電熱恒溫培養箱。
1. 2 方法 菌體的活化從-80℃取出嗜酸乳桿菌復蘇純化, 37℃、14 h活化兩代。
1. 2. 1 菌懸液的制備 將上述活化后的第三代嗜酸乳桿菌菌液用0.85% (W/V) 的無菌氯化鈉溶液分別梯度稀釋至10-5、10-6、10-7, 備用。
1. 2. 2 涂布方法及平板放置時間的影響檢測 分別采用圓形、井字、先圓形后井字和90°轉動平板橫線4種涂布方法, 將10-5、10-6、10-7三個稀釋度的菌液涂布在分別放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培養48 h后, 挑選菌落數在30~300的平板計數。
2 結果
2. 1 不同涂布方法對于活菌數的影響不明顯, 而對于同一涂布方法來說, 平板放置12 h后, 微生物生長的菌落數最低。見圖1。
2. 2 通過觀察發現不同涂布方法相對標準偏差均大約在10%以內。見表1。
3 討論
“2. 1結果”可能是由于培養基在放置12 h后內部的水分活度沒有其他時間段利于微生物的生長[3]。由于在試驗過程中發現平板放置3 h時培養基表面較滑, 不利于涂布操作。綜合考慮, 選擇放置6~9 h的平板更適于菌落計數。
測定樣品中的菌數方法主要有顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法、濁度測量法、粒子計數法、三磷酸腺苷(ATP)生物發光法、電阻抗測量法、放射測量法、接觸酶測量法等。這些方法都存在各自的適用范圍及優缺點。平板菌落計數法具有能檢測出活菌數, 更真實地反映樣品狀況以及重復性好, 樣品中菌數高或低都適用的特點, 因此在藥品研究及實踐中廣泛應用。但是對于平板菌落計數法的影響因素研究卻甚少, 通過本研究發現, 涂布方法對于平板菌落計數的影響是不顯著的。相反, 平板的放置時間對于最終菌落計數的結果有顯著性影響, 當培養基放置時間過長(>12 h)時, 水分活度的改變會影響所培養微生物的生長。這利于提高平板菌落計數的準確性, 對更好地控制食品、藥品中微生物的數量具有重要意義。
參考文獻
[1] 李華. 平板菌落計數的改進方法. 生物學通報, 2006, 41(1):51-54.
[2] 張松青, 王鑫, 鄭笠. 麻荊止咳顆粒微生物限度檢查方法的建立. 海峽藥學, 2014, 12(34):78-79.
在臨床醫學中,一個較為重要的內容就是臨床微生物檢驗技術。由于新感染病的出現、耐藥菌的涌現、常見感染病原譜的變遷和易感人群的不斷增加,使得感染性疾病并沒有象人類曾經所預料的那樣隨著抗感染化療時代的到來而逐一銷聲匿跡。相反,近年來感染性疾病又重新成為人類關注的熱點。新時期,我國臨床微生物檢驗技術如何順應形勢的發展,積極幫助臨床做好感染性疾病的救治工作已顯得十分迫切。
一、臨床微生物檢驗的基本原則
發現感染應及時采集微生物標本作病原學檢查,二、三級醫院微生物標本送檢率不應低于70%。 盡量在抗菌藥物使用之前采集標本。 標本采集時應嚴格無菌操作,減少或避免機體正常菌群及其它雜菌污染。標本采集后應立即送至細菌室。床旁接種可提高病原菌檢出率。以棉拭子采集的標本如咽拭子、肛拭或傷口拭子,宜插入運送培養基送檢。 送檢標本應注明來源和檢驗目的,使細菌室能正確選用相應的培養基和適宜的培養環境。
二、標本采集質量對微生物檢驗質量的影響
標本采集主要有兩種形式,分別是患者自行采集和醫生采集。提高檢出率的重要因素就在于一定要進行正確采集標本。標本采集時,一定要進行嚴格的無菌操作,避免標本感染而產生誤檢,直接影響微生物檢驗的臨床檢驗診斷。
1、血標本的采集:對于寒戰患者和間歇性發熱患者,尤其是間歇性菌血癥患者,應該在其體溫寒戰期或上升期進行采集血液。采集的血量兒童一般采集1~5mL,成人一般采集8~10mL。為了有效地提高其血液培養的陽性率,采集血標本時應該掌握好其采集血的頻率、部位、容量、時間等因素,另外,還應該在24h內,從患者不同的身體部位采集2~3份血樣。
2、膿標本的采集:應該將膿標本的采集置于用抗生素之前,這樣可以避免出現無細菌生長的情況發生。因膿標本分為兩種,分別是外源性和內源性,采集外源性的膿標本時,選定膿標本采集部位的時候應該選擇深部的膿腫部位。采集標本完之后,馬上就送到檢驗部門進行檢驗,只有這樣才能夠有效地避免出現細菌中途死亡的問題。而相對于采集外源性的膿標本而言,采集內源性的膿標本更加困難,需要在在無菌操作下進行病理切片。
3、痰標本的采集:應該患者需要不斷地進食,那么自然患者口腔內的菌群會隨著攝入變質的食物的數量增加而增加,所以在痰標本的采集時,務必要囑咐患者避免使用牙膏,用干凈清水漱口來清潔口腔,避免出現雜菌導致誤檢的情況發生。在采集痰標本之后,應該馬上用無菌器皿封裝,快速送往微生物室進行檢驗。對咳嗽乏力或昏迷病人,可用吸痰管經鼻腔或口抵達氣管腔內吸引痰液。用纖維支氣管鏡可直接在病灶部位采集高濃度的感染病原菌,但不能完全避免咽喉部正常菌群感染。 痰標本不能及時送檢者,可暫存4℃冰箱。室溫下擔擱數小時定植于口咽部的非致病菌呈過度生長而肺炎鏈球菌、葡萄球菌和流感嗜血桿菌檢出率明顯降低
4、 尿標本的采集:為避免尿標本的采集的過程中受到污染,應該要囑咐患者認真清洗尿道口和外陰,在睡前少飲水,最好為晨尿中的中段尿。。因尿內含有大量有利于細菌生長的營養成分,所以應該盡快送檢,控制在采集尿標本之后的一小時之內,這樣才能夠避免出現誤檢。
5、其他標本采集:采集厭氧菌培養標本時,務必要清楚厭氧培養適合于哪些標本;對于采集大便標本而言,應該將性狀與顏色都較為特殊的部分直接放入無菌容器內。
三、臨床微生物檢驗的心得體會
1、積極向臨床醫師和護士宣傳微生物檢驗的新方法、新技術和新概念。比如血培養技術改進原理,特別在提高陽性率、縮短培養結果報告時間等方面的優越性;真菌顯色培養基在念珠菌快速培養和菌種鑒定中的價值;快速細菌鑒定和藥敏測試儀。臨床醫師只有在正確了解新技術的發展和臨床意義后,才會積極應用于臨床工作實踐,即增加了標本的送檢率。 同時,還應該指導臨床開展微生物標本檢驗項目的正確選擇、采樣與運送方法。微生物檢驗項目的選擇、標本 采集和 運送方法正確與否直接影響標本的檢驗質量,是我們能否準確及時的將檢驗結果反饋給臨床的重要保證。
2、及時更新和評估檢驗方法、操作規程,提高檢驗質量。微生物學是一門古老而又充滿生機、不斷發展的學科。近幾十年來,感染的病原譜和耐藥性發生許多變化,臨床微生物檢驗技術也在 不斷創新和完善之中,因此定期更新和評估檢驗方法十分重要。
3、協助臨床正確閱讀和分析微生物檢驗報告單。近年來,不少感染性疾病特別是醫院感染的病原 譜和 藥敏譜發生 很大變化。以往罕見的微生物頻頻出現在檢驗報告單上,藥敏試驗的方法、受試品種、結果解釋也又不少改變。臨床醫師對利用臨床微生物檢驗資料發生了空前的困惑。微生物室應積極與臨床溝通,幫助解決臨床醫師在判讀微生物檢驗和藥敏結果報告單時的困難。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鑒別與判斷;檢驗報告為少見菌或罕見菌的意義;細菌培養陰性時的可能原因;藥敏試驗結果判讀標準和局限性等。
參考文獻:
〔1〕 張卓然.臨床微生物學和微生物檢驗〔M〕.北京:人民衛生出版社,2003
〔2〕 李秀珍.微生物檢驗質量控制工作體會〔J〕.現代醫藥衛生,2004
關鍵詞:食品;不確定度;菌落總數;檢測
測量不確定度是指表征合理地賦予被測量之值的分散性,與測量結果相聯系的參數,測量結果的完整表示中應包括測量不確定度。因此,正確評定測量不確定度對客觀分析測量結果,進行實驗室質量管理具有重要的意義。【1】在ISO\IEC 17025:2005中明確指出:“檢測實驗室應具有并應用評定測量不確定度的程序”。【2】
食品的衛生狀況與人們健康的關系極為密切。食品中微生物的檢測是評價食品質量的重要衛生指標之一,而食品中菌落總數是反映食品污染度的重要指標。
在食品微生物學中,基質對測量不確定度的影響是不可避免的,因此本文以同樣基質的10個樣品進行分析。依據:ISO\TS 19036:2006《食品微生物學 測量不確定度評估指南》,GB 4789.2-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》,探討食品中菌落總數檢測結果不確定度的評估方法。
1 實驗部分
1.1 基質:10分相同基質的涼菜,分別設為樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10。
1.2操作:操作A和操作B:分別代表測試員A和測試員B的操作,而且操作A與操作B不在同一日期進行。
1.3檢測依據:GB 4789.2-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。
1.4培養基:由青島海博生物技術提供的平板計數瓊脂。
1.5檢測儀器:賓得生化培養箱、壓力蒸汽滅菌器、冰箱、拍打式均質器、渦旋振蕩器、1ml移液器。
1.6檢測過程:分別進行無菌操作,將25g樣品剪碎到無菌均質袋中,加入225ml滅菌生理鹽水,根據樣本的污染情況,選擇2~3個稀釋度,每個稀釋度做2個平皿。及時將培養基注入平皿約15ml混勻,置36度培養箱內培養48h±2h,計數后,按標準規定的方法計算菌落總數結果。【3】
1.7檢測結果:
2 數學模型及不確定度來源
2.1根據GB 4789.2-2010,建立菌落總數的計算公式為:
(N為菌落總數,d為第一稀釋度,C為可計數平板菌落數之和,n1和n2為可計數稀釋倍數的平板數。當僅一個稀釋倍數的平板菌落數在計數范圍內時,n2=0。)
2.2不確定度分量的主要來源
菌落總數的不確定度主要由系統性效應和隨機效應引起。本實驗的不確定度與樣品稀釋、操作者、時間、溫度、培養基和人員計數有關。
2.3評估原理
ISO/TS 19036:2006標準采用整體法評估測量不確定度。它以影響測試結果的分析程序的總變量為基礎進行評估,其中,總變量包括可觀察到的精密度(任意成分)和偏差(系統成分)。在食品微生物領域的實際應用中,通常僅考慮精密度。測量不確定度的整體法評估,是對全部測量程序最終結果可再現性的標準偏差進行實驗性評估得到的。該標準偏差相當于合成標準不確定度。【4】
2.4計算
依照慣例,在計算之前,數據(微生物計數結果)單位應從CFU/g或CFU/ml轉換為log10(CFU/g)或log10(CFU/ml)。
計算n個給定基質樣品的再現性標準差SR的方法見式:
式中:
yij--對數轉換值,單位為log10(CFU/g)或log10(CFU/ml)
i--樣品的序號, =1-n(n≥10)
j--再現性條件的編號,j=A或j=B
3 測量不確定度報告
3.1測量不確定度的標示
不確定度表述的方法可以為log10為單位的區間、自然值(每克或每毫升的CFU值)或百分比。
按照《測量不確定度表示指導》的定義,擴展不確定度U為合成標準不確定度uc(y)和包含因子k的乘積。取k值為2(大約對應95%的置信水平)。
測試結果可按照以下形式進行報告:
(1) ;
(2) ;
(3)xCFU/g或xCFU/ml ;
(4)xCFU/g或xCFU/ml
3.2不確定度的計算
根據表1計算再現性標準偏差:
以1號樣品A操作為例(7.0×105CFU/g),測試結果可報告為:(5.85-0.14)log10~(5.85+0.14)log10,查反對數表,結果為512861CFU/g~977237CFU/g。
4 小結
測量不確定度評估是實驗室質量體系的重要組成部分。有關菌落總數檢測結果不確定度的報道也越來越多,有人提出對同一樣品進行多次重復測試來評估;有人提出合并樣品方差來評估;也有人采用了Seppo I Niemela提出的根據菌落泊松分布特點去評估不確定度。【4】本文通過整體法評估了菌落總數檢測的不確定度,用實驗室內的再現性標準偏差來獲取測量不確定度。在日常工作中具有很強的操作性,比較適宜用于菌落計數的不確定度評估。
參考文獻
【1】雷質文.食品微生物實驗室質量管理手冊[M].北京:中國標準出版社.
【2】ISO\IEC 17025:2005檢測和校準實驗室認可準則[S]
【3】GB 4789.2-2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定[S]
1資料與方法
1.1一般資料
選擇內蒙古疾病預防控制中心下發的樣品測試內容對奶粉中所含食源性致病菌進行檢驗,對檢驗結果實施定性分析。生化反應鑒定要求到屬或者種。
1.2方法
1.2.1儀器、試劑
檢驗所用主要儀器設備為恒溫培養箱,VITEK2-compact細菌鑒定分析系統(生產企業:法國梅里埃公司生產)。所用培養基以及試劑主要由BD、北京陸橋技術、法國科瑪嘉、青島海博有限公司提供。經過檢定及校準,研究中所用儀器設備、試劑等均在有效期內。
1.2.2研究方法
本次研究主要以《2016年食源性致病菌監測工作手冊》、食品衛生微生物學檢驗標準[1]作為參照,對所選樣品實施微生物檢驗。在檢驗過程中實施室內質量控制,保證檢驗所得相關結果的真實可靠性和準確性。
1.2.3實驗室檢驗
①無菌操作分別將樣品接種mLST-Vm肉湯、李氏增菌肉湯LB、緩沖蛋白胨水、腸道菌增菌肉湯、氯化鈉堿性蛋白胨水(3%)、改良EC肉湯、氯化鈉肉湯(7.5%)、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中,然后放置于恒溫培養箱中適當溫度環境中進行適當時間的培養。②分別挑取以上增菌液接種至阪崎腸桿菌顯色平板、TSA、PALCAM平板、沙門菌顯示平板、HE、XLD、TCBS平板、弧菌顯色平板、MAC、大腸顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、B-P平板、MYP平板中,放置恒溫培養箱適當溫度環境中進行適當時間的培養。③對增菌液中細菌的生長情況進行密切觀察,對平板上菌落特點進行密切觀察;④在MAC菌落特點為粉紅色、中等大小菌落,大腸顯色平板上為藍色菌落。阪崎腸桿菌顯色平板上為藍綠色菌落,在TSA上為黃色菌落。其它平板上無可疑菌落。⑤選取平板上可疑菌落進行涂片染色鏡檢;挑MAC、大腸顯色平板、阪崎腸桿菌顯色平板及TSA上可疑菌落接種至TSI(三糖鐵)、MIU(動力-靛基質-脈酶)、普通平板中,并進行培養。⑥對MIU、TSI結果進行觀察,選取普通平板上出現的菌落實施氧化酶實驗。選取兩種可疑菌純培養物行生化鑒定。
2結果
主要檢出致病菌為大腸埃希氏菌和阪崎腸桿菌。增菌之后行接種選擇平板相關操作和所獲得的結果均與直接接種法相同。本次研究結果上報內蒙古疾病預防控制中心。質控樣品檢驗獲得“滿意”結果。
3討論
在實施食品安全微生物檢驗中,微生物實驗室間比對試驗為一種對實驗室檢測結果的可靠性、準確性進行驗證的最有效措施之一[2]。目前,在食品安全風險監測室間,主要選用該種方法對微生物檢驗結果實施質控考核。在質控考核過程中,相關分析工作人員必須具備扎實的實驗室檢測專業知識及操作技能,同時還必須對醫學檢驗、食品衛生檢驗所涉及的相關知識,操作步驟和流程等均有全面了解,并嫻熟掌握,在實際工作過程中,還須充分結合實際情況,對污染樣品中可能存在的相關病原菌進行全面考慮[3]。在實施細菌鑒定過程中,工作人員須時刻保持清晰思路。同時實施增菌、直接劃平板,對增菌以及分離培養基進行合理選擇,保證培養基營養狀況以及培養環境的溫濕度等能夠符合培養條件,在檢驗過程中最大限度降低漏檢率,提高檢出率。在常規樣品檢測、實驗室間質控考核工作的實施過程中,均須首先要保證室內質量控制,保證實驗室檢測結果的精準性。同時,在檢驗工作的開展過程中,檢驗及分析工作人員必要要重視每份樣品,嚴格按照相關要求和標準實施檢驗流程及操作。只有這樣才能保證樣品微生物檢驗過程中設計的樣品采集、樣品處理、細菌染色、培養基選擇、試劑使用等各個環節均能夠保持良好的精準性,進而保證樣品微生物檢驗結果的可靠及準確性。在食品衛生檢驗工作中,食品微生物檢驗為一個不可或缺的重點內容。相關機構必須定期對食品微生物檢驗實施實驗室間質量控制考核,對實驗結果進行嚴格把關,進而推動衛生檢疫人員不斷提高自身專業知識技能及素質,促進實驗室檢測水平得到不斷提升,進而保證食品微生物檢驗工作能夠有序、快速進行,并保證檢驗質量,進而為衛生監督執法部門工作的開展提供可靠依據,保證食品衛生安全。
作者:曲桂娟 許杰 單位:內蒙古赤峰市疾病預防控制中心
參考文獻
[1]柳勤,葉新,張惠文,等.2015年天河區食品安全風險監測微生物結果與分析[J].中國衛生檢驗雜志,2016,14(10):540-541.