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在廢水處理中,生物處理法是最為經(jīng)濟(jì)適用的廢水處理方法,而微生物在生物處理過(guò)程中又起到至關(guān)重要的作用,利用微生物治理水污染有著廣闊的發(fā)展前景。本文重點(diǎn)探討微生物在廢水處理中的應(yīng)用。
關(guān)鍵詞:
環(huán)保;微生物;應(yīng)用
環(huán)境保護(hù)是我國(guó)的基本國(guó)策。隨著水污染問(wèn)題的日益嚴(yán)峻,水資源危機(jī)嚴(yán)重威脅人類的生存環(huán)境。在廢水處理中,生物處理法是最為經(jīng)濟(jì)適用的廢水處理方法,而微生物在生物處理過(guò)程中又起到至關(guān)重要的作用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,構(gòu)建基因工程菌已成現(xiàn)實(shí),所以,利用微生物治理水污染有著廣闊的發(fā)展前景。本文重點(diǎn)探討微生物在廢水處理中的應(yīng)用。
1廢水中常見(jiàn)的微生物
2微生物在廢水處理方面的應(yīng)用
微生物處理廢水的機(jī)理就是通過(guò)微生物的新陳代謝活動(dòng),把廢水中的有機(jī)物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的、無(wú)害的物質(zhì),從而達(dá)到凈化廢水的方法。根據(jù)微生物新陳代謝過(guò)程中是否有氧的參與,廢水的微生物凈化方法分為好氧凈化和厭氧凈化。
2.1好氧凈化在有氧的條件下,好氧微生物通過(guò)自身的分解、合成代謝,把廢水中的有機(jī)物礦物化的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中,微生物不僅自身得到了生長(zhǎng)、繁殖。廢水也得到凈化。廢水微生物好氧凈化法就是模擬這個(gè)原理來(lái)凈化污水的。目前常用的好氧廢水處理法有:活性污泥法、生物膜法、氧化塘法等?;钚晕勰喾?活性污泥其實(shí)就是廢水中的好氧微生物生長(zhǎng)、繁殖形成的一種絮狀體。其生物組成為好氧微生物、兼性厭氧微生物和專性厭氧微生物、有機(jī)和無(wú)機(jī)固體等?;钚晕勰嗑哂泻軓?qiáng)的吸附、氧化分解有機(jī)物或毒物的能力。活性污泥法處理廢水就是利用活性污泥的吸附、氧化、分解、凝聚和沉淀等作用來(lái)凈化水中的有機(jī)污染物。廢水中的有機(jī)物的降解轉(zhuǎn)化過(guò)程就是活性污泥中的好氧微生物的新陳代謝活動(dòng)。為保證最佳凈水效果,就要保證微生物良好的新陳代謝。氧的充足供應(yīng)是好氧微生物進(jìn)行正常生命活動(dòng)的首要條件。所以,首先要保證氧的供應(yīng)。此外,還要滿足微生物生命活動(dòng)最適宜的溫度(15-30℃)和ph值(6.5-8.5)等。生物膜法:這種處理法的實(shí)質(zhì)是使細(xì)菌等微生物和原生動(dòng)物、后生動(dòng)物等附著在濾料或載體上生長(zhǎng)繁育,并在其上形成膜狀生物污泥---生物膜。常見(jiàn)的生物膜法有生物濾池、生物轉(zhuǎn)盤(pán)、生物接觸氧化、生物流化床等。氧化塘法氧化塘中,廢水中的污染物主要通過(guò)懸浮于廢水中的有機(jī)菌藻共生作用、水中微生物代謝活動(dòng)進(jìn)行降解,水中藻類光合作用能增高溶解氧濃度,氧化塘廢水中的細(xì)菌可將廢水有機(jī)物分解變成二氧化碳、硝酸根等無(wú)機(jī)物,沉積于污泥中的有機(jī)物則可通過(guò)厭氧菌分解成甲烷、硫化氫等被藻類利用,從而使廢水得到凈化。
2.2厭氧凈化在嚴(yán)格厭氧的條件下,微生物發(fā)酵和消化有機(jī)物產(chǎn)生水、二氧化碳、硫化氫、甲烷的過(guò)程。廢水的厭氧處理法就是根據(jù)這一原理來(lái)凈化污水的。因在處理過(guò)程中產(chǎn)生甲烷,又稱甲烷發(fā)酵。廢水中復(fù)雜有機(jī)物的厭氧降解過(guò)程分四個(gè)階段,即:水解階段、發(fā)酵階段、產(chǎn)乙酸階段、產(chǎn)甲烷階段。不同的階段有著不同的微生物優(yōu)勢(shì)種群。在水解發(fā)酵階段中,廢水中的大分子有機(jī)物,首先在細(xì)菌胞外酶的作用下,水解轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)物后,被梭狀芽孢桿菌屬、丁酸弧菌屬、雙歧桿菌屬和假單胞菌屬等吸收、轉(zhuǎn)化為更為簡(jiǎn)單的化合物分泌到胞外,主要產(chǎn)物是醇類、揮發(fā)性的脂肪酸、乳酸、二氧化碳、氫氣、氨等等。在產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸階段中,這些產(chǎn)物繼續(xù)被互營(yíng)單胞菌屬、互營(yíng)桿菌屬、暗桿菌屬和梭菌屬等酸化細(xì)菌進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸、氫氣、碳酸及新的細(xì)胞物質(zhì)。在產(chǎn)生甲烷階段中,前一階段的產(chǎn)物被甲烷桿菌屬、甲烷球菌屬和甲烷八疊球菌屬等甲烷菌群利用轉(zhuǎn)化為甲烷菌細(xì)胞物質(zhì),并產(chǎn)生甲烷氣體。整個(gè)廢水厭氧發(fā)酵過(guò)程涉及多種菌替作用,每種菌群都有不同的生活基質(zhì)和生活條件要求,構(gòu)成了一個(gè)極為復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。這種廢水處理方法不僅菌群獲得營(yíng)養(yǎng),廢水得到凈化,還能開(kāi)發(fā)新的生物能源,所以倍受人們重視。
3利用分子生物學(xué)技術(shù),人工構(gòu)建基因工程菌處理廢水
相比較于傳統(tǒng)的微生物處理廢水法,利用基因工程菌處理廢水是當(dāng)前用微生物處理廢水的重要發(fā)展方向,它具有定向性和高效性的特點(diǎn)。構(gòu)建的基因工程菌,不僅能在廢水處理過(guò)程中快速繁殖、絮凝,滿足數(shù)量需求,而且在高毒環(huán)境的水體中,也具有高效的分解、轉(zhuǎn)化性能,甚至可以針對(duì)特異的污染物進(jìn)行分解、轉(zhuǎn)化,基因工程菌也可以廣泛的分解污染物。隨著基因工程技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,基因工程菌對(duì)凈化環(huán)境、保護(hù)人類健康將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,基因工程菌在廢水處理中的應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛。微生物法處理廢水不僅具有效率高、成本較低的特點(diǎn),而且處理后的水質(zhì)好,可以直接排放到大自然中。在自然界,廣泛的存在著大量的微生物。微生物具有易培養(yǎng)、易變異、繁殖快、適應(yīng)能力強(qiáng)等特征。隨著基因工程技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,構(gòu)建定向、高效分解污染物的微生物已成為現(xiàn)實(shí)。所以,利用微生物治理廢水是今后環(huán)保產(chǎn)業(yè)的主攻方向,合理利用微生物處理廢水具有非常廣闊的發(fā)展前景。
參考文獻(xiàn)
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藥學(xué)專業(yè)主要課程 主要課程:基本原理、思想道德修養(yǎng)、法律基礎(chǔ)、大學(xué)英語(yǔ)、高等數(shù)學(xué)、醫(yī)用物理學(xué)、計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)、形態(tài)學(xué)概論、生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)。
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、病理生理學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、定量分析、儀器分析、物理化學(xué)、基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)、藥物化學(xué)、天然藥物化學(xué)、藥劑學(xué)、藥物分析、藥理學(xué)、毒理學(xué)基礎(chǔ)、藥物的波譜解析、藥事管理學(xué)、專業(yè)技能實(shí)驗(yàn)等。
藥學(xué)專業(yè)就業(yè)前景 我國(guó)的藥學(xué)事業(yè)的發(fā)展也是非常迅猛的,許多藥品都得到了國(guó)際市場(chǎng)的認(rèn)可,也與外國(guó)企業(yè)建立了合作關(guān)系,但在專業(yè)人才方面有稀缺,這表明藥學(xué)專業(yè)有很廣闊的發(fā)展前景。
社會(huì)對(duì)藥學(xué)才的需求正在增加,本專業(yè)的大學(xué)生就業(yè)率高達(dá)95%。制藥業(yè)發(fā)展較快,尤其是生活水平提高以后,人們對(duì)保健品的需求在增大,企業(yè)對(duì)藥學(xué)人才比較青睞。還有一塊就是生化藥品,這是一個(gè)新興也是尖端的行業(yè),發(fā)展前景很好。
藥學(xué)專業(yè)畢業(yè)生主要分配到制藥廠和醫(yī)藥研究所從事各類藥物開(kāi)發(fā)、研究、生產(chǎn)質(zhì)量保證和合理用藥等方面的工作,也有很多人從事藥品銷售。
藥學(xué)專業(yè)就業(yè)方向 本專業(yè)學(xué)生畢業(yè)后可可以到制藥廠和醫(yī)藥研究所從事各類藥物開(kāi)發(fā)、研究、生產(chǎn)質(zhì)量保證和合理用藥等方面的工作,藥學(xué)專業(yè)就業(yè)方向也有很多人從事藥品銷售。
從事行業(yè):
畢業(yè)后主要在制藥、醫(yī)療、新能源等行業(yè)工作,大致如下:
1 制藥/生物工程;
2 醫(yī)療/護(hù)理/衛(wèi)生;
3 新能源;
4 醫(yī)療設(shè)備/器械;
5 批發(fā)/零售。
從事崗位:
畢業(yè)后主要從事醫(yī)藥代表、銷售代表、產(chǎn)品經(jīng)理等工作,大致如下:
1 醫(yī)藥代表;
2 銷售代表;
3 產(chǎn)品經(jīng)理;
4 藥劑師;
基于與業(yè)務(wù)主管部門和登記注冊(cè)管理部門前期積極的工作交流,“人才聯(lián)盟”落戶海南進(jìn)入加速實(shí)施階段,相關(guān)人才項(xiàng)目的準(zhǔn)備工作基本完成,現(xiàn)將近期工作匯報(bào)如下:
一、“人才聯(lián)盟”申請(qǐng)成立進(jìn)度
積極與相關(guān)領(lǐng)導(dǎo)深入溝通交流,在充分闡述“人才聯(lián)盟”成立的初衷、即將開(kāi)展的業(yè)務(wù)范圍、廣泛深遠(yuǎn)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義以及發(fā)展前景的基礎(chǔ)上,對(duì)可行性征詢材料進(jìn)行了系統(tǒng)的完善。
“人才聯(lián)盟”籌備委員會(huì)已經(jīng)在第一時(shí)間通知所有發(fā)起單位、會(huì)員單位以及捐資單位按照成立登記申請(qǐng)相關(guān)要求完成相關(guān)材料的整理,近期提交籌委會(huì)進(jìn)行審核、報(bào)送社會(huì)團(tuán)體管理處。
二、首批外籍院士工作站項(xiàng)目
為抓緊落實(shí)人才交流大會(huì)上關(guān)于“百位外籍院士入海南”的簽約合作以及推進(jìn)首批外籍院士工作站項(xiàng)目,“人才聯(lián)盟”籌委會(huì)依托聯(lián)盟平臺(tái)優(yōu)勢(shì)整合國(guó)際人才資源,已經(jīng)累計(jì)與24名外籍院士及2名重要領(lǐng)域博士確立合作關(guān)系,外籍院士及博士分別來(lái)自俄羅斯、烏克蘭、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦和中國(guó),涉及領(lǐng)域涵蓋公共衛(wèi)生、醫(yī)療、環(huán)境保護(hù)、新能源、可再生能源、生物科學(xué)、生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)技術(shù)、新材料、機(jī)械科學(xué)、電真空技術(shù)、船舶技術(shù)設(shè)計(jì)和物理化學(xué)等領(lǐng)域,分別為農(nóng)業(yè)學(xué)、無(wú)線電物理學(xué)、低溫物理學(xué)、聲學(xué)、熱物理學(xué)、光學(xué)、固態(tài)物理學(xué)、核物理學(xué)、雷達(dá)技術(shù)、電磁場(chǎng)與微波技術(shù)、高功率微波技術(shù)、超導(dǎo)體學(xué)、生物能源、新能源、綜合醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、高科技醫(yī)學(xué)工程、微血管學(xué)、心臟外科、分子診斷、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、天然及合成化合物技術(shù)、化學(xué)物理學(xué)、晶體量子化學(xué)、固體量子化學(xué)、高分子物理學(xué)、高分子化合物、納米材料、復(fù)合材料、聚合過(guò)程動(dòng)力熱力學(xué)、動(dòng)力工程學(xué)、爆炸物理學(xué)、核技術(shù)以及流體力學(xué)等學(xué)科的專家。2名外籍博士為各自所在領(lǐng)域的高端技術(shù)研究人才,所掌握技術(shù)為無(wú)線電應(yīng)用和探地雷達(dá)領(lǐng)域核心技術(shù),可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的空白。
【關(guān)鍵詞】生物催化技術(shù)發(fā)展化學(xué)制藥研究
生物催化是指通過(guò)酶或生物有機(jī)體的催化作用實(shí)現(xiàn)生物的化學(xué)轉(zhuǎn)化,故又被稱為生物轉(zhuǎn)化。隨著科技的進(jìn)步和發(fā)展,生物催化逐漸進(jìn)入人們的生產(chǎn)生活,從根本上改善了人們的經(jīng)濟(jì)效益、能源消耗和原料來(lái)源,對(duì)環(huán)境保護(hù)也作出了積極貢獻(xiàn)。生物催化技術(shù)是生物技術(shù)改革中的第三次浪潮,成為歷年來(lái)生物技術(shù)中的標(biāo)志性技術(shù)。
1.生物催化技術(shù)及其發(fā)展
(1)生物催化技術(shù)。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)指出,生物酶催化技術(shù)是目前工業(yè)發(fā)展中最有利于可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)技術(shù)。生物催化技術(shù)主要涉及到化學(xué)領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域,在醫(yī)藥化工領(lǐng)域中可通過(guò)酶或微生物的催化作用實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生物的轉(zhuǎn)化。生物催化技術(shù)在很大程度上促使衍生物往多樣性方向發(fā)展,實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾及簡(jiǎn)單分子化合物庫(kù)的新建,產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)生物催化后能夠延伸出現(xiàn)的生理活動(dòng)物質(zhì)。
先導(dǎo)化合物在生物催化作用下具有一定的優(yōu)越性,主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn):①可能反應(yīng)的產(chǎn)物范圍大;②在反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需進(jìn)行脫保護(hù)和基團(tuán)保護(hù),一步便可完成相關(guān)反應(yīng);⑧實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的定向立體選擇和區(qū)域選擇;④生物催化的反應(yīng)條件溫和,利于穩(wěn)定復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu);⑤在均一和溫和的反應(yīng)條件下可獲取反應(yīng)的重現(xiàn)性及實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的自動(dòng)化;⑥由于酶具有固定化特性,故在生產(chǎn)過(guò)程中可反復(fù)循環(huán)使用催化劑。
(2)生物催化技術(shù)的發(fā)展。生物催化技術(shù)的提出是源于科學(xué)家對(duì)活體細(xì)胞成分的認(rèn)識(shí),一部分的專家和學(xué)者認(rèn)為某些細(xì)胞成分可用于特定條件下的化學(xué)轉(zhuǎn)化。例如苯甲醛從植物中提取后與氫氰酸結(jié)合可制成(R)一苯乙醇腈,半合成抗生素的生產(chǎn)則依靠G酞基轉(zhuǎn)移酶的幫助。1980年后,隨著科技的發(fā)展和進(jìn)步,蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到空前的發(fā)展,使得酶的底物范圍大大增加,實(shí)現(xiàn)了常見(jiàn)合成中間物的生物合成。在此科技背景之下,生物催化技術(shù)逐漸被運(yùn)用于精細(xì)化化學(xué)和藥物中間體生產(chǎn)領(lǐng)域。
(3)隨著近年來(lái)基因合成、生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)工程和序列分析等觀念的進(jìn)步及電腦建模和生物學(xué)工具的更新,越來(lái)越多的專家學(xué)者在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上對(duì)分子進(jìn)行快速進(jìn)化處理,極大的改善了原有的生物催化劑。生物催化劑經(jīng)過(guò)改造后可穩(wěn)定處:T-60℃的有機(jī)溶液中,在接受新的底物時(shí)可自動(dòng)催化新的生物反應(yīng)。
2.化學(xué)制藥中的生物催化技術(shù)研究
在生物催化技術(shù)的發(fā)展背景之下,酶和微生物反應(yīng)成為生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。許多長(zhǎng)期研究微生物和酶的專家學(xué)者開(kāi)始著手于有機(jī)合成的研究,促使生物催化技術(shù)逐漸發(fā)展成為一項(xiàng)不對(duì)稱合成的生物技術(shù)。
(1)西他列汀游離堿。美國(guó)的Codexis公司和德國(guó)的Merck公司通過(guò)酶做催化劑實(shí)現(xiàn)西他列汀游離堿的生產(chǎn)。他們較早發(fā)現(xiàn)R構(gòu)型選擇性轉(zhuǎn)氨酶的分子結(jié)構(gòu)類似于西他列汀酮,其中一些分子質(zhì)量較小的可阻斷甲基酮并具有一定活性。而后Codexis公司對(duì)轉(zhuǎn)氨-酶進(jìn)行改造,實(shí)現(xiàn)了一種催化加氫路線的構(gòu)建,且在生產(chǎn)過(guò)程中并不產(chǎn)生S豐勾型西他列汀酮。由于該生物技術(shù)具有一步到位的優(yōu)點(diǎn),故設(shè)備的生產(chǎn)能力和分子的反應(yīng)能力得到有效提高,且在一定程度上降低了廢棄物品的產(chǎn)出。
(2)阿伐他?。⑵胀祝?-氰3和5一二羥基乙酸叔丁酯是阿伐他?。⑵胀祝┥a(chǎn)過(guò)程中需要的活性中間體,美國(guó)Codexis公司通過(guò)生物催化實(shí)現(xiàn)此種活性中間體的生產(chǎn)。Codexis公司以分子重組為基礎(chǔ),采用了最先進(jìn)的直接優(yōu)化技術(shù),開(kāi)發(fā)了具有穩(wěn)定性、選擇性和活性的3種酶。前手性氯酮在2種優(yōu)化酶手性選擇性的催化作用下發(fā)生氫化反應(yīng),生成純手性的氯乙醇。
(3)普瑞巴林。美國(guó)的Pfizer公司通過(guò)生物催化的方式實(shí)現(xiàn)普瑞巴林的生產(chǎn)?;诘鞍踪|(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行改造的水解酶問(wèn)世后,運(yùn)用該水解酶會(huì)對(duì)S-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的鉀鹽進(jìn)行選擇性水解,在溫和條件下物質(zhì)發(fā)生一系列水解反應(yīng),最終得到普瑞巴林。-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸在脂肪酶的選擇性水解下產(chǎn)出-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的鉀鹽,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)合成,實(shí)現(xiàn)普瑞巴林的制備,可獲取40%的最終收率,通過(guò)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的檢測(cè)可得其ee值為99.7%。
基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及人才培養(yǎng)的思考
訪問(wèn)辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心見(jiàn)聞與啟示
全科醫(yī)師實(shí)踐技能培訓(xùn)短期效果評(píng)價(jià)
醫(yī)學(xué)研究生導(dǎo)師評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的構(gòu)建
中華醫(yī)學(xué)會(huì)系列雜志關(guān)于論文題名的規(guī)定
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以問(wèn)題為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)在中醫(yī)教育中的應(yīng)用
醫(yī)學(xué)研究生科研實(shí)踐中的問(wèn)題及對(duì)策
醫(yī)學(xué)碩士研究生課程體系的改革與實(shí)踐
醫(yī)學(xué)院校實(shí)習(xí)權(quán)利的研究與對(duì)策分析
全球背景下的中國(guó)醫(yī)學(xué)教育改革
藥物分析課程體系與教學(xué)模式改革的探討
重慶市急診急救專科護(hù)士培訓(xùn)現(xiàn)狀調(diào)查分析
獨(dú)立學(xué)院人才培養(yǎng)方案的特色構(gòu)建研究
醫(yī)學(xué)研究生實(shí)驗(yàn)室生物安全教育狀況實(shí)證研究
建設(shè)高水平大學(xué)的緣由、實(shí)踐與比較
博士學(xué)位論文雙盲評(píng)審的實(shí)踐與思考
淺談如何提高青年教師生物化學(xué)教學(xué)質(zhì)量
醫(yī)科獨(dú)立學(xué)院創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式探析
參加農(nóng)村衛(wèi)生適宜技術(shù)項(xiàng)目培訓(xùn)有感
英語(yǔ)專業(yè)(醫(yī)學(xué)方向)人才培養(yǎng)模式研究
將科研創(chuàng)新引入本科人才培養(yǎng)的模式探索
博洛尼亞進(jìn)程中的俄羅斯高等醫(yī)學(xué)教育
知識(shí)產(chǎn)權(quán)制度對(duì)科技獎(jiǎng)勵(lì)制度影響的初步探討
中美醫(yī)學(xué)教育差異對(duì)八年制教學(xué)的啟示
生物醫(yī)學(xué)工程碩士專業(yè)學(xué)位研究生教學(xué)探索
臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士研究生循證素質(zhì)培養(yǎng)
KPI考核在附屬醫(yī)院教學(xué)管理部門的實(shí)踐
基于GMER理念的生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)
臨床技能培訓(xùn)課程與醫(yī)學(xué)生培養(yǎng)的關(guān)系研究
研究生學(xué)位論文答辯工作存在的問(wèn)題與對(duì)策
關(guān)于中醫(yī)本科教育的幾點(diǎn)思考
我國(guó)民辦高等醫(yī)學(xué)院校發(fā)展前景研究
獨(dú)立設(shè)置醫(yī)科大學(xué)學(xué)科融合的重要意義
對(duì)免疫學(xué)理論模塊教學(xué)目標(biāo)的思考
PBL教學(xué)法在局部解剖學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用
關(guān)鍵詞 嗜鹽菌;高鹽濃度;細(xì)菌視紫紅質(zhì)
中圖分類號(hào):Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1671-7597(2013)13-0009-02
1 嗜鹽菌的嗜鹽機(jī)制
1.1 嗜鹽菌的細(xì)胞壁
1.1.1 成分的特異性
嗜鹽菌細(xì)胞壁不含有肽聚糖,卻有富含酸性氨基酸的糖蛋白,這些帶有負(fù)電荷的氨基酸比如谷氨酸、天門冬氨酸等。這樣在高鹽濃度的溶液里面,鈉離子會(huì)結(jié)合在嗜鹽菌的表面,正好屏蔽掉這些氨基酸所帶的負(fù)電荷。因此Na+對(duì)于嗜鹽菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整具有重要意義。
1.1.2 嗜鹽菌細(xì)胞壁對(duì)一定鹽濃度的依賴性
嗜鹽菌在高鹽的溶液里,鈉離子會(huì)結(jié)合在嗜鹽菌細(xì)胞壁表面,屏蔽其所帶的負(fù)電荷。當(dāng)溶液中的鈉離子不足或鈉離子被稀釋時(shí),蛋白質(zhì)的負(fù)電荷部分就會(huì)互相排斥,細(xì)胞壁會(huì)一塊一塊地破碎,最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解。
1.2 嗜鹽菌的細(xì)胞膜
1.2.1 嗜鹽菌細(xì)胞膜上的細(xì)菌視紫紅質(zhì)
嗜鹽菌細(xì)胞膜上含有與視覺(jué)中的視紫紅質(zhì)相類似的蛋白質(zhì),被稱為細(xì)菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin,bR)。細(xì)菌視紫紅質(zhì)有光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵功能。細(xì)菌視紫紅質(zhì)中視黃醛分子的結(jié)構(gòu)一般是全-反式(all-trans),但是在光照條件下,視黃醛分子會(huì)發(fā)生13-順式(13-cis)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)化,H+經(jīng)中間形態(tài)泵出膜外,最后細(xì)菌視紫紅質(zhì)返回初態(tài)B,這樣就完成了光循環(huán)。隨著質(zhì)子累積在膜的外表面,質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力增加,直到膜兩側(cè)的質(zhì)子差可以驅(qū)動(dòng)膜上的ATP酶時(shí),ATP酶就可以開(kāi)始ATP的合成。因此,嗜鹽菌可以利用光能進(jìn)行低速增長(zhǎng),使嗜鹽菌更能適應(yīng)一些能量不足的環(huán)境。
1.2.2 嗜鹽菌細(xì)胞膜保鉀排鈉的功能
嗜鹽菌細(xì)胞質(zhì)中的Na+離子的濃度并不高,但是細(xì)胞質(zhì)中的K+離子的濃度卻很高,可以高達(dá)7 mol/L。這是由于某些嗜鹽菌具有Na+/K+反向轉(zhuǎn)運(yùn)功能,而這種功能是正是利用了光介導(dǎo)的H+質(zhì)子泵,它具有向外排放Na+和吸收和濃縮K+的能力。這樣可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓來(lái)對(duì)抗細(xì)胞外的高滲環(huán)境,提高它的耐鹽性。
1.3 嗜鹽菌的細(xì)胞質(zhì)
1.3.1 嗜鹽菌細(xì)胞質(zhì)維持胞內(nèi)滲透壓平衡的方法
嗜鹽菌主要依靠?jī)蓷l途徑來(lái)維持胞內(nèi)滲透壓平衡,其一是細(xì)胞中聚集無(wú)機(jī)鹽離子如K+,其二是聚集相容性物質(zhì)如糖類、甜菜堿和四氫嘧啶等。嗜鹽菌還能產(chǎn)生和積累一些相容性溶質(zhì),既能幫助正常的細(xì)胞代謝活動(dòng),又有助于平衡胞內(nèi)外滲透壓。比如在一種嗜鹽外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira sp.)中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀氨基酸,它在細(xì)胞內(nèi)含量可達(dá)0.25 mol/L,約占胞內(nèi)全部有機(jī)溶質(zhì)的10%,成為此類嗜鹽菌的主要的滲透壓調(diào)節(jié)劑,有助于穩(wěn)定和保護(hù)菌體內(nèi)酶的活性,使其能夠在高鹽濃度下正常生長(zhǎng)。
1.3.2 嗜鹽菌中酶與蛋白質(zhì)的嗜鹽機(jī)制
高鹽溶液會(huì)使普通蛋白質(zhì)的水膜遭到破壞,導(dǎo)致蛋白質(zhì)間的疏水作用加強(qiáng),使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變換,甚至失活變性。而在嗜鹽菌的細(xì)胞質(zhì)中,卻含有高濃度的鉀離子。這些鉀離子不僅能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓的平衡,也是嗜鹽菌酶與蛋白質(zhì)保持活性的條件。嗜鹽菌的酶與普通蛋白質(zhì)不同,它在酶的表面引入了酸性氨基酸的殘基。酸性氨基酸能在蛋白質(zhì)和酶表面形成一層薄薄的水保持層,阻止蛋白質(zhì)分子與酶相互碰撞,從而避免了它們之間的凝集。同時(shí),堿性氨基酸殘基能與酸性氨基酸形成鹽橋來(lái)消除鹽離子的屏蔽效應(yīng)。相反在低鹽濃度下,由于電荷的排斥作用,酶和蛋白質(zhì)就會(huì)變性失活。
2 嗜鹽菌嗜鹽機(jī)制的應(yīng)用前景
2.1 細(xì)菌視紫紅質(zhì)在生物電子領(lǐng)域的應(yīng)用
細(xì)菌視紫紅質(zhì)的非線性光學(xué)性、瞬態(tài)光電響應(yīng)性和光致變色性等都特別優(yōu)秀,因此它在很多方面都擁有廣闊的前景,比如生物芯片、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、人工視網(wǎng)膜和光信息存儲(chǔ)等領(lǐng)域都有發(fā)展前景。另外,在太陽(yáng)能利用方面,利用bR蛋白質(zhì)的質(zhì)子泵作用,可以研制天然的太陽(yáng)能電池和對(duì)海水進(jìn)行淡化。
2.2 利用嗜鹽菌處理高鹽度廢水
高鹽度廢水大量含有無(wú)機(jī)鹽離子和有機(jī)物質(zhì)。過(guò)高離子濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)有十分強(qiáng)烈的毒性,因此高鹽度廢水給生物處理帶來(lái)一定的難度。利用生物方法處理高濃度的污染物,就必須用到嗜鹽菌。大多數(shù)專家認(rèn)為,利用生物法處理高鹽度廢水在技術(shù)上是可行的,因?yàn)樵诟啕}環(huán)境中嗜鹽菌對(duì)污染物的降解作用十分有效。而嗜鹽菌對(duì)于鹽度的高低十分敏感,鹽度對(duì)于嗜鹽菌處理有機(jī)污染物的脫氮、除磷和降解都有或大或小的影響。因此想要用嗜鹽菌處理高鹽度廢水的方法實(shí)施起來(lái),還需要在很多方面進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。
2.3 利用嗜鹽菌研制工業(yè)耐鹽酶
工業(yè)上使用的耐鹽酶很多都是來(lái)自嗜鹽菌。在以色列,Mevarechy領(lǐng)導(dǎo)的小組在大腸桿菌中將嗜鹽二氫葉酸和蘋(píng)果酸脫氫酶基因成功表達(dá)出來(lái),這使得耐鹽酶也能在大腸桿菌中生產(chǎn)。嗜鹽菌在工業(yè)廢水處理中也有很大的作用,嗜鹽堿放線菌(Nocrdioides sp.M6)對(duì)于2,4,6-三氯酚有很強(qiáng)的降解作用,利用這一特性,可以來(lái)處理工業(yè)廢水,還可用于環(huán)境治理等。
2.4 嗜鹽菌相容性溶質(zhì)的應(yīng)用
嗜鹽菌在高鹽度的環(huán)境中,在胞內(nèi)形成了很多相容性溶質(zhì)。這些溶質(zhì)包括甘氨酸甜菜堿、四氫嘧啶、谷氨酰胺和海藻糖等。羥基四氫嘧啶和四氫嘧啶可以作為穩(wěn)定劑,它可以保護(hù)蛋白質(zhì)等,使其抗凍、抗鹽、抗干燥。在很多化妝品中,羥基四氫嘧啶和四氫嘧啶都是其中的重要成分,例如德國(guó)的莫克公司就曾經(jīng)生產(chǎn)過(guò)一種化妝品,就利用它來(lái)抗衰老和抗干燥,作為保濕劑。
3 總結(jié)
嗜鹽菌是極端環(huán)境微生物的重要類群,其深入的研究有利于闡明生物多樣性形成的機(jī)制和與極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制,具有極為重要的科學(xué)意義。國(guó)內(nèi)外研究?jī)?nèi)容涉及極端嗜鹽菌微生物的資源調(diào)查、物種分析和生化適應(yīng)分機(jī)理研究等,其應(yīng)用研究主要集中在極端嗜鹽酶類、生物表面活性物質(zhì)和生物納米材料“紫膜”等方面的開(kāi)發(fā)利用。近年來(lái),極端微生物分子生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面亦取得重要進(jìn)展。嗜鹽菌在高鹽環(huán)境中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化,已經(jīng)成功適應(yīng)了并且依賴上了高濃度鹽環(huán)境,擁有了自己獨(dú)有的嗜鹽方法與機(jī)制。我們應(yīng)該加大對(duì)嗜鹽菌的研究,從中我們可以發(fā)現(xiàn)很多生命的奧秘,同時(shí)可以開(kāi)發(fā)其用途,進(jìn)一步造福于人類。
參考文獻(xiàn)
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然而,生命的機(jī)制像是一種構(gòu)件眾多而構(gòu)造復(fù)雜的偶合反應(yīng)鏈系統(tǒng),如果不能找到對(duì)其核心的基因組行之有效的分析技術(shù),科學(xué)家們的諸多探索努力也不過(guò)零敲碎打、徒勞無(wú)功。
如何取得突破?福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院特聘教授蔡偉文創(chuàng)立福州大學(xué)應(yīng)用基因組學(xué)研究所,在攻克世界公認(rèn)的比較基因組雜交芯片技術(shù)后,繼續(xù)帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì),在基因研究這片神秘的天地努力探索。
求學(xué)
上世紀(jì)80年代,蔡偉文進(jìn)入中山大學(xué)化學(xué)系。在那個(gè)以陳景潤(rùn)為科學(xué)偶像的火熱年代,更多“天之驕子”愿意選擇數(shù)學(xué)、物理專業(yè)。在老師的勸阻中仍然堅(jiān)定地選擇了化學(xué)系,是這個(gè)高分考生做出的第一個(gè)在人們意料之外的決定?!爱?dāng)時(shí)我說(shuō)不愿意轉(zhuǎn)到物理系,因?yàn)椴幌矚g隨大流,如果千軍萬(wàn)馬都去做一件事情,那么也不一定有很多機(jī)會(huì)。”這話一出口,周圍人就開(kāi)始意識(shí)到,這個(gè)早慧又內(nèi)斂的廣東青年,藏著顆做大事的雄心。
1987年,蔡偉文研究生畢業(yè)后到華南理工大學(xué),擔(dān)任化學(xué)教師。用他的話來(lái)說(shuō),這是一段相對(duì)沉悶的時(shí)光,“不知道往哪兒走。一方面我看到的社會(huì)還很落后,很多人需要知識(shí)與技術(shù)。比如鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)大多是農(nóng)民辦起來(lái)的,他們碰到很多技術(shù)問(wèn)題,知識(shí)的匱乏會(huì)讓人們面對(duì)非常簡(jiǎn)單的問(wèn)題束手無(wú)策。另一方面,當(dāng)時(shí)的研究體系還沒(méi)有深入到為中小企業(yè)服務(wù)的程度。”在學(xué)校里,蔡偉文是沒(méi)有條件做科研的,但他又心有不甘,于是他從工資里面拿錢買試劑做試驗(yàn)?!耙粋€(gè)月工資加補(bǔ)助100多塊錢,勉強(qiáng)支撐”。
留學(xué)政策稍微松動(dòng)了一點(diǎn),蔡偉文就在講臺(tái)上“出走”了,步履匆忙又曲折,但是難以撼動(dòng),也就是在此時(shí),他做出了第二個(gè)“出格”的專業(yè)選擇:“要去美國(guó)留學(xué),我就在想要做什么呢?比我早出去幾年的同行,都繼續(xù)研究化學(xué)了,這個(gè)學(xué)科還是挺成熟的,但我還是想做一些新型研究,希望能有更廣闊的發(fā)展前景,收獲更大?!?/p>
憑著似乎與生俱來(lái)的科學(xué)敏感度,蔡偉文看到,生物技術(shù)未來(lái)將大有可為?!爱?dāng)時(shí)我對(duì)生物技術(shù)很感興趣,自己也做了一些基礎(chǔ)學(xué)習(xí),感到能有所作為的機(jī)會(huì)比較多,但是由于我是化學(xué)背景,申請(qǐng)不到生物系,所以我就選了一所學(xué)校,它的化學(xué)系基本上研究生物相關(guān)方面的化學(xué),比如蛋白質(zhì)、核酸DNA這一類的研究?!?/p>
入行
1991年年初,蔡偉文獲得獎(jiǎng)學(xué)金進(jìn)入美國(guó)紐約大學(xué),師從國(guó)際知名的基因組分析技術(shù)專家David Schwartz教授攻讀博士學(xué)位。“導(dǎo)師是專搞DNA研究的,當(dāng)時(shí)就是核酸分析技術(shù),這是分子生物學(xué)的一個(gè)核心的東西。我選擇他的實(shí)驗(yàn)室時(shí),很多人都勸我說(shuō)專業(yè)不對(duì)口,但我還是去了,而且非常興奮,因?yàn)樗愕臇|西和別的化學(xué)研究是不一樣的。”這個(gè)在當(dāng)時(shí)看來(lái)過(guò)于冒險(xiǎn)的決定,讓他驚喜萬(wàn)分。“像一位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者說(shuō)的那樣,誰(shuí)接觸到DNA研究都會(huì)發(fā)狂,因?yàn)樘嗟目蒲蟹较蛑档蒙钊胙芯苛?。?/p>
蔡偉文果然“發(fā)狂”了,僅僅半年時(shí)間,他就完成了博士階段的課題研究,此后不久,又創(chuàng)立了大分子DNA單分子限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)表面固定直接定位方法。這種方法的成功展示確立了DNA單分子物理定位方法的可行性,他的研究成果很快為紐約大學(xué)帶來(lái)了校史上最大一筆工業(yè)界研究資助――約1500萬(wàn)美元。
“我的導(dǎo)師原來(lái)是搞電泳研究的,他發(fā)明了一種技術(shù),就是脈沖電泳。以前電泳里是通過(guò)穩(wěn)壓電壓直流跑,但他改用交替脈沖電流來(lái)跑膠,可讓以前無(wú)法分離的大片段的DNA分離開(kāi)。說(shuō)得形象一點(diǎn),DNA分子就像劉翔跨欄一樣,凝膠就像是欄,大的跳得慢,小的跳得快,這樣就能夠分開(kāi)。但是其中有一個(gè)問(wèn)題懸而未決,就是我們的技術(shù)不能分離很大的東西,比如很大的核酸,這好比都在高速路上,沒(méi)什么欄桿要跨,小車跟大卡車速度其實(shí)都差不多。所以,我的導(dǎo)師發(fā)明了一個(gè)技術(shù),把它脈沖一下,我讓它跑停、跑停再加速,大的肯定加速就慢,小的就加速快,將分子拉開(kāi)?!辈虃ノ奶岬?,這項(xiàng)技術(shù)非常有用,解決了傳統(tǒng)技術(shù)不能解決的很多問(wèn)題,但是DNA分子為什么能夠分開(kāi)呢?導(dǎo)師給他布置了“作業(yè)”,成了他的博士論文題目。為了完成研究,蔡偉文決定模仿導(dǎo)師的做法,把整個(gè)過(guò)程錄下來(lái),把機(jī)理展示給人看。當(dāng)時(shí)覺(jué)得很難,但事實(shí)上,他只用了半年時(shí)間,就基本上把過(guò)程拍得一清二楚了。
攻克了博士課題,蔡文偉有了更多的空閑時(shí)間,實(shí)驗(yàn)室里的其他同事正糾結(jié)于大分子DNA內(nèi)切酶切點(diǎn)定位研究。自從1959年美國(guó)物理學(xué)家費(fèi)曼在演說(shuō)中提到,“倘若我們能按意愿操縱一個(gè)個(gè)原子,將會(huì)出現(xiàn)什么奇跡?”操縱單個(gè)分子、單個(gè)原子就一直是科學(xué)家們追求的目標(biāo),導(dǎo)師的整個(gè)實(shí)驗(yàn)室也都圍繞著相關(guān)課題進(jìn)行研究,眼看著不少同事耗費(fèi)了大量時(shí)間一無(wú)所獲,蔡偉文決定另辟蹊徑,“想把內(nèi)切酶定位放置在DNA分子鏈上后做物理圖譜,是比較理想化了,一個(gè)小時(shí)才盯住看一個(gè)分子,基因組大概有兩三萬(wàn)個(gè)片斷,什么時(shí)候能把圖譜都做出來(lái)。我們不過(guò)是要那個(gè)信息,完全可以切完以后再去看,不需要將整個(gè)酶切過(guò)程錄像”。
“我也花了些時(shí)間研究DNA怎么粘,不粘DNA怎么把它固定,這個(gè)環(huán)節(jié)還不算難,難點(diǎn)在于,你要把DNA分子拉直并固定在表面上,同時(shí)酶還能把它切開(kāi)。沒(méi)人這樣做過(guò),我也不知道這樣行不行?!?/p>
又是半年廢寢忘食的反復(fù)試驗(yàn),內(nèi)切酶弄不開(kāi),切不掉,跟死在上面一樣。蔡偉文耗盡了心力,終于發(fā)現(xiàn),如果有足夠的時(shí)間,這種思路是完全可行的。大分子DNA單分子限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)表面固定直接定位方法一旦取得突破,整個(gè)實(shí)驗(yàn)室就活起來(lái)了,論文迅速發(fā)表,資金投入進(jìn)來(lái),目前這項(xiàng)研究成果已經(jīng)應(yīng)用到儀器上,邁入了商業(yè)化軌道。
立業(yè)
杰出的科研成績(jī),讓蔡偉文順利拿到了博士學(xué)位。他又一次走到了專業(yè)選擇的十字路口。
現(xiàn)實(shí)又堅(jiān)硬的社會(huì)生態(tài),讓他更清晰地看到了美國(guó)城市的叢林法則,“工作崗位并不是一成不變的,競(jìng)爭(zhēng)性很強(qiáng),流動(dòng)性很大,整個(gè)社會(huì)都在一個(gè)不斷優(yōu)化組合的狀態(tài)中。所以我就想,做什么才是最有發(fā)展前景的”。
基因芯片很快吸引了他的注意力。此時(shí),隨著分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展,越來(lái)越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定,基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長(zhǎng)。建立新型雜交和測(cè)序方法以對(duì)大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)、分析就顯得越來(lái)越重要。
而基因芯片的檢測(cè)原理是核酸雜交方法的微型化,通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列檢定的方法,在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列,與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí),通過(guò)確定熒光強(qiáng)度,獲得樣本中待檢序列完全互補(bǔ)的探針序列的數(shù)量。蔡偉文介紹說(shuō),“我感到它特別適合我的研究背景,因?yàn)閹啄陙?lái),我就是在看DNA怎么固定在表面上,而做基因芯片的核心技術(shù)就是這樣的。比對(duì)了一些已經(jīng)發(fā)表的論文,我感到他們的的核心技術(shù)和我們的設(shè)想相比,有很大差距,所以就更加有信心了”。
1996年年底,蔡偉文獲得耶魯大學(xué)管理的Jane Coffin Childs紀(jì)念基金資助,并進(jìn)入美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院分子與人類遺傳系,師從國(guó)際知名的轉(zhuǎn)基因技術(shù)專家Allan Bradley教授從事博士后研究。博士后研究期間,他順利開(kāi)發(fā)出了獨(dú)特的生物芯片制備方法并獲得專利,徹底解決了當(dāng)時(shí)基因芯片技術(shù)應(yīng)用中困擾學(xué)術(shù)界的非特異性表面熒光背景問(wèn)題。不久之后,在關(guān)鍵技術(shù)的基礎(chǔ)上,蔡偉文成功開(kāi)發(fā)出實(shí)用的比較基因組雜交芯片技術(shù),成為世界上第一個(gè)“吃螃蟹”的人。與此同時(shí),他提出一種了創(chuàng)新的大基因組高效測(cè)序策略,并在貝勒醫(yī)學(xué)院的人類基因組測(cè)序中心得到實(shí)施,用于多個(gè)基因組的測(cè)序項(xiàng)目中。
提及技術(shù)突破,蔡偉文中肯地說(shuō):“專門想搞技術(shù)為生的人非常少,原因有兩個(gè):第一,技術(shù)研究難度大;第二,發(fā)表東西十分緩慢,放在當(dāng)下功利化的評(píng)價(jià)系統(tǒng)里面,它產(chǎn)出不是很高。我們做技術(shù)又經(jīng)常遇到細(xì)節(jié)問(wèn)題,卡在一個(gè)環(huán)節(jié)上,就很難推進(jìn),但是,如果想做前沿研究就意味著很多東西得從頭做起。咱們中國(guó)古話說(shuō),工欲善其事,必先利其器。傳統(tǒng)技術(shù)3年才能做到的事情,利用新技術(shù)可能我們幾個(gè)星期就可以完成了,甚至能突破以前沒(méi)法做到的事。”
同樣是在2000年,蔡偉文被貝勒醫(yī)學(xué)院分子與人類遺傳系破格提升為終身教職線助理教授并兼任貝勒醫(yī)學(xué)院的人類基因組測(cè)序中心助理教授,開(kāi)始主持獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室,圍繞獨(dú)創(chuàng)的比較基因組雜交芯片技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行規(guī)?;夹g(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究。這個(gè)實(shí)驗(yàn)室是全球唯一同時(shí)擁有覆蓋人和小鼠的全基因組BAC克隆芯片的實(shí)驗(yàn)室。源于同一技術(shù)優(yōu)勢(shì),蔡偉文的實(shí)驗(yàn)室最先觀察到人類和小鼠的基因組中普遍存在的大片段DNA拷貝數(shù)變化的現(xiàn)象。目前對(duì)這一現(xiàn)象的研究已成為基因組學(xué)研究的一大熱門方向。
豐碩的研究成果,讓蔡偉文成為是國(guó)際公認(rèn)的比較基因組雜交芯片技術(shù)的先驅(qū)者之一;兩度任加拿大重大基因組項(xiàng)目評(píng)審專家;曾主持和參與近十項(xiàng)由美國(guó)NIH、NCI、能源部和宇航局資助的研究項(xiàng)目;在權(quán)威國(guó)際學(xué)術(shù)雜志發(fā)表48篇具有重要?jiǎng)?chuàng)見(jiàn)的學(xué)術(shù)論文,已獲得6項(xiàng)美國(guó)授權(quán)專利,待授權(quán)專利多項(xiàng)。
拓路
2011年,蔡偉文受聘為福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院特聘教授,創(chuàng)立福州大學(xué)應(yīng)用基因組學(xué)研究所,主要研究方向是將新一代DNA芯片技術(shù)和新的DNA測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,對(duì)臨床重大難題,如多種癌癥和出生缺陷的基因缺陷特征進(jìn)行廣泛和深入研究,并致力于將現(xiàn)在國(guó)際上的前沿研究成果推向臨床應(yīng)用。為了加速度搭建國(guó)內(nèi)的科研平臺(tái),他又做了一件史無(wú)前例的事情,花了數(shù)量可觀的美金將美國(guó)實(shí)驗(yàn)室的整套設(shè)備自費(fèi)買出來(lái),以整體平移的方式置入福州大學(xué)。
提及這個(gè)細(xì)節(jié),他說(shuō):“我回國(guó)的想法很簡(jiǎn)單,首先,我的技術(shù)在出生缺陷的產(chǎn)前篩查方面有比較好的應(yīng)用前景。優(yōu)生優(yōu)育是我們國(guó)家的一個(gè)政策,但說(shuō)實(shí)話,現(xiàn)在并沒(méi)有什么特別好的技術(shù)。我在研究技術(shù)應(yīng)用的時(shí)候,所有的環(huán)節(jié)都是考慮中國(guó)如何使用而設(shè)定的,如果技術(shù)推出去,首先希望造福自己的同胞。”除此之外,蔡偉文還對(duì)出生缺陷的相關(guān)基因研究十分感興趣。在這一方面,國(guó)內(nèi)也可以找到不少罕見(jiàn)的病例。
計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展飛快,已經(jīng)漸漸融入人們?nèi)粘I畹狞c(diǎn)點(diǎn)滴滴中,快速發(fā)展中不免有些隱患,因此謹(jǐn)慎分析現(xiàn)狀也是十分有必要的,對(duì)計(jì)算機(jī)科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展也有著積極意義。如今,計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)作為一個(gè)生命力強(qiáng)、發(fā)展前景良好的科學(xué)技術(shù),在個(gè)人、家庭、企業(yè)乃至國(guó)家各個(gè)層面區(qū)域的應(yīng)用都很廣泛,在開(kāi)發(fā)成本、運(yùn)行速度以及使用性能等方面都取得了不小的突破。同時(shí),計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展也帶動(dòng)了集成電路技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、軟件工程、材料科學(xué)等領(lǐng)域的快速發(fā)展,各個(gè)行業(yè)相輔相成,共同向前進(jìn)步發(fā)展。在這個(gè)信息化的時(shí)代,計(jì)算機(jī)已經(jīng)融入了千家萬(wàn)戶的生活與工作中,在各個(gè)行業(yè)如工農(nóng)業(yè)、文化教育行業(yè)、社會(huì)服務(wù)業(yè)等之中都發(fā)揮著不可代替的重要作用,對(duì)于社會(huì)來(lái)說(shuō)已是不可缺少的一部分。其中最重要的則是計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)在社會(huì)生產(chǎn)方面的作用。隨著全球信息化時(shí)代的進(jìn)步,人與人之間、生活與工作之中,信息傳遞是格外重要的。而計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)則是通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)的作用改善信息傳遞的方式,加快其速度,從而促進(jìn)了信息技術(shù)行業(yè)的發(fā)展。同時(shí),人們對(duì)于信息的認(rèn)識(shí)也與日劇增,從而對(duì)信息選擇的要求也越來(lái)越高,精確性、有效性、及時(shí)性都是人們所追求的目標(biāo)。由于計(jì)算機(jī)與網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)行形勢(shì),使得人們的勞動(dòng)方式與工作模式也得到了轉(zhuǎn)變。秀才不出門,能知天下事。人們可以足不出戶得完成工作與學(xué)習(xí)任務(wù),節(jié)省了更多人力物力去完成其他的事情,對(duì)行動(dòng)與思想方面也有一定的解放作用。這正是說(shuō)明了科技乃人類社會(huì)第一生產(chǎn)力。另外,計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)帶動(dòng)了信息技術(shù)的發(fā)展,信息技術(shù)也推動(dòng)著電子技術(shù)、生物技術(shù)以及新能源新技術(shù)的研發(fā)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。
2計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展前景
2.1生物計(jì)算機(jī)
早在1994年3月就有一位美國(guó)科學(xué)家提出了生物計(jì)算機(jī)這一設(shè)想。將DNA堿基序列當(dāng)做信息的編碼載體,利用當(dāng)今的分子生物學(xué)技術(shù),適當(dāng)使用控制酶,改變DNA堿基序列并使信息有效反映出來(lái),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算。DNA計(jì)算機(jī)設(shè)想的出現(xiàn)有效拓寬了人類對(duì)計(jì)算機(jī)了解的視野,改變了計(jì)算機(jī)僅僅只是簡(jiǎn)單是物理性操作的性質(zhì),增加了操作方式。如今,英國(guó)生物信息研究院的研究人員做出的重大突破使得人們對(duì)信息儲(chǔ)存的認(rèn)識(shí)有了進(jìn)一步的轉(zhuǎn)變??茖W(xué)家們將文學(xué)家莎士比亞的154首詩(shī)歌的音樂(lè)文件(mp3格式)以及相關(guān)的照片編制了DNA序列,使得儲(chǔ)存密度大大增高,這一消息使得人們對(duì)生物計(jì)算機(jī)的構(gòu)想進(jìn)一步貼近現(xiàn)實(shí)。
2.2量子計(jì)算機(jī)
其特性即原子的同一時(shí)間點(diǎn)處于不同位置之間。在數(shù)據(jù)信息處理,數(shù)據(jù)儲(chǔ)存兩方面,量子位的能力較晶體管電子位來(lái)說(shuō)都是存在很大進(jìn)步的。
2.3光子計(jì)算機(jī)
光子計(jì)算機(jī)做出的重大突破即為可以利用光速來(lái)完成電子儲(chǔ)存以及運(yùn)算等工作,與傳統(tǒng)的芯片計(jì)算機(jī)相比其運(yùn)行速度大大增加。其實(shí)早在20世紀(jì)50年代后期就有科學(xué)家提出光子計(jì)算機(jī)這一設(shè)想,同時(shí)這一設(shè)想也在逐漸向現(xiàn)實(shí)發(fā)展前進(jìn)著。1986年,戴維•米勒研制出小型的光開(kāi)關(guān),使得貝爾實(shí)驗(yàn)室的艾倫•黃研制的光處理器有了一定的基礎(chǔ),在1990年的1月,光計(jì)算機(jī)的工作正式開(kāi)啟。在元器件方面,光計(jì)算機(jī)有兩種類型,即光電混合型與全光學(xué)型。貝爾實(shí)驗(yàn)室成功工作的光計(jì)算機(jī)采用的就是混合型元器件。然而相比全光學(xué)光子計(jì)算機(jī),其運(yùn)行速度還是有些遜色的。要想將全光學(xué)光子計(jì)算機(jī)成功的研發(fā)并制作出,必需研發(fā)出一種特殊的“晶體管”,這種晶體管能夠用一條光來(lái)控制另一條光。然而現(xiàn)今存在的光學(xué)“晶體管”存在很大的問(wèn)題,笨拙且較大的體積是無(wú)法適用在光子計(jì)算機(jī)里的。因此,對(duì)光子計(jì)算機(jī)的研發(fā)工作還需要很大的努力,還有很長(zhǎng)的一段路要走。
3總結(jié)
基因擴(kuò)增是分子生物學(xué)領(lǐng)域的常用研究手段,目前應(yīng)用最廣的是常規(guī)PCR和real-timePCR技術(shù)[1],因其靈敏度高,特異性強(qiáng),已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。但PCR方法的操作較復(fù)雜,對(duì)操作人員和儀器設(shè)備的要求都較高,不適合基層及現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),新技術(shù)不斷涌現(xiàn),TsugunoriNotomi等[2]于2000年提出了LAMP,一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù),利用該技術(shù)只需在恒溫條件下(60~65℃)保溫幾十分鐘就可快速完成核酸的擴(kuò)增,無(wú)需購(gòu)置昂貴的PCR儀,操作簡(jiǎn)單,快速,可用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè),近年來(lái)已得到廣泛的應(yīng)用。本文綜述了LAMP技術(shù)的基本原理、相對(duì)于傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)、產(chǎn)物的檢測(cè)方法及其臨床應(yīng)用,最后指出LAMP目前存在的不足以及應(yīng)采取的相應(yīng)措施,并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望,從而為L(zhǎng)AMP技術(shù)在臨床研究上的應(yīng)用提供參考。
1LAMP法的原理及特點(diǎn)
1.1LAMP引物的設(shè)計(jì)LAMP技術(shù)的核心之一在于引物的設(shè)計(jì),因此,設(shè)計(jì)出特異性強(qiáng)的引物是進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)的首要任務(wù)。LAMP引物由一對(duì)內(nèi)引物(FIP與BIP)和一對(duì)外引物(F3與B3)組成,其中FIP由F1c和F2組成,BIP由B1c和B2組成,嚴(yán)格針對(duì)靶基因3'端的F1c、F2c和F3c區(qū)以及5'端的B1、B2和B3區(qū)而設(shè)計(jì)[3],結(jié)構(gòu)組成如圖1所示。
1.2擴(kuò)增原理DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),此時(shí),任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí),另一條鏈就會(huì)解離,變成單鏈[4,5]。據(jù)此,LAMP反應(yīng)被劃分為2個(gè)階段,即起始物合成階段和循環(huán)擴(kuò)增階段。在第1階段,內(nèi)引物FIP首先與模板F2c區(qū)結(jié)合,啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成,產(chǎn)生雙鏈DNA。接著,引物F3與F3c互補(bǔ)配對(duì),在BstDNA聚合酶的作用下,啟動(dòng)鏈置換反應(yīng),并釋放出由FIP引導(dǎo)合成的單鏈,此單鏈的5'末端存在互補(bǔ)序列(F1c和F1),于是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成一環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板,與FIP和F3類似,在BIP和B3的作用下,在DN段的另外一端產(chǎn)生了新的環(huán)狀結(jié)構(gòu),于是整條鏈呈啞鈴狀結(jié)構(gòu)[6],如圖2所示,到此,第1階段反應(yīng)完成。循環(huán)擴(kuò)增階段,以啞鈴狀結(jié)構(gòu)為模板,F(xiàn)IP與莖環(huán)區(qū)域F2c雜交,同時(shí),F(xiàn)1c與F1結(jié)合,啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng),解離出由F1引導(dǎo)合成的雙鏈核酸,并釋放由F2引導(dǎo)合成的單鏈,此單鏈兩端均成環(huán)狀結(jié)構(gòu),BIP與莖環(huán)區(qū)域B2c互補(bǔ),啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。如此不斷循環(huán),莖的長(zhǎng)度和環(huán)的個(gè)數(shù)都不斷增加,最后的產(chǎn)物為莖-環(huán)狀DNA與花椰菜狀DNA所組成的混合物。
1.3LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與普通PCR相比,LAMP具有許多優(yōu)點(diǎn):①特異性強(qiáng),引物的設(shè)計(jì)須嚴(yán)格針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域,任何一個(gè)不匹配就會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行;②靈敏度高,可檢測(cè)出1~10拷貝的模板,比PCR高出10倍的檢測(cè)限[7];③反應(yīng)時(shí)間短,只需在恒溫條件下保溫30~60min就可完成擴(kuò)增;④設(shè)備簡(jiǎn)單,不需要昂貴的PCR儀和特殊的試劑,只需一臺(tái)恒溫設(shè)備就可進(jìn)行;⑤產(chǎn)物易檢測(cè),只需用肉眼觀察有無(wú)白色渾濁或有無(wú)綠色熒光,就可判斷擴(kuò)增是否發(fā)生。LAMP與普通PCR的比較結(jié)果見(jiàn)表1。
1.4LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定常用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)、熒光比色檢測(cè)和熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)
1.4.1濁度檢測(cè)隨著核酸的大量生成,溶液中會(huì)發(fā)生如下反應(yīng):(DNA)n-1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4-7與溶液中的鎂離子結(jié)合,生成肉眼可見(jiàn)的焦磷酸鎂白色沉淀,通過(guò)與陰性管比較反應(yīng)液的渾濁情況,或用濁度儀檢測(cè)其在400nm處的沉淀濁度,就可判斷擴(kuò)增的有無(wú)。
1.4.2熒光比色檢測(cè)對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行熒光比色檢測(cè)時(shí),常用的染料有SYBRGreenⅠ、鈣黃綠素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等[8]。其中,SYBRGreenⅠ和HNB的檢測(cè)靈敏度最高,是鈣黃綠素的10倍[9],然而SYBRGreenⅠ不能在反應(yīng)前加入LAMP體系中,否則會(huì)抑制反應(yīng)[10],而反應(yīng)后加就必須開(kāi)蓋,又違反了LAMP不開(kāi)蓋原則,造成氣溶膠污染。HNB則是在反應(yīng)前加入體系中,避免了開(kāi)蓋污染的問(wèn)題,擴(kuò)增結(jié)束后,陽(yáng)性管呈紫色,陰性管呈天藍(lán)色,由此,可判斷靶基因的有無(wú)。
2LAMP技術(shù)的應(yīng)用
LAMP技術(shù)自2000年開(kāi)發(fā)以來(lái),因其簡(jiǎn)便快速,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和動(dòng)物胚胎性別鑒定等檢測(cè)中。
2.1細(xì)菌的檢測(cè)YoshiteruAoi等[11]利用LAMP對(duì)環(huán)境中的氨氧化細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果可檢測(cè)出10個(gè)拷貝數(shù)的DNA,具有與real-timePCR相同的靈敏度,且背景DNA對(duì)LAMP的檢測(cè)干擾很小,可忽略不計(jì)。徐芊等[12]將LAMP用于檢測(cè)副溶血弧菌,直接對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè),只用一臺(tái)恒溫水槽,65℃反應(yīng)1h,即完成擴(kuò)增反應(yīng),與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比,大大縮短了檢測(cè)周期,檢測(cè)限達(dá)到89cfu/g。葉宇鑫等[13]將原位熒光LAMP技術(shù)應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢測(cè),與傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)方法和PCR方法相比,原位熒光LAMP無(wú)需破碎細(xì)胞提DNA,反應(yīng)方便易行,耗時(shí)少;恒溫條件(63℃)下反應(yīng),避免了原位PCR方法過(guò)高的循環(huán)溫度(95℃)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞;在檢測(cè)人工污染的樣品時(shí),結(jié)果沒(méi)有受到雜質(zhì)的影響,可以檢測(cè)到樣本中的單個(gè)細(xì)胞。張宏偉等[14]以莢膜脂多糖合成調(diào)控子resA為靶基因片段,設(shè)計(jì)了肺炎克雷伯菌特異性引物,建立了LAMP檢測(cè)方法,靈敏度可達(dá)2.2~3.4CFU/100g,檢測(cè)流程可縮短至2d,比PCR法更加快速。董培陪等[15]結(jié)合LAMP與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(Lateralflowdipstick,LFD)建立起一種鰻利斯頓氏菌快速檢測(cè)方法,能在30min內(nèi)完成檢測(cè),靈敏度為7.7cfu/ml,比常規(guī)PCR方法高一個(gè)數(shù)量級(jí),通過(guò)與橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)技術(shù)結(jié)合,進(jìn)一步克服了由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性??梢?jiàn),將LAMP技術(shù)用于細(xì)菌檢測(cè)時(shí),其檢測(cè)限比常規(guī)PCR更高,與real-timePCR法相比則具有相同的靈敏度,無(wú)需分離培養(yǎng)細(xì)菌,可直接提取感染動(dòng)物組織基因組進(jìn)行擴(kuò)增[16],操作更為簡(jiǎn)單、方便,且不需要昂貴的儀器,該方法有望成為細(xì)菌檢測(cè)的常規(guī)手段。
2.2病毒的檢測(cè)
2.2.1DNA病毒TingCai等[17]利用LAMP方法檢測(cè)血清樣本中的HBV,并與real-timePCR法進(jìn)行了比較,結(jié)果表明兩者的檢出率一致,且對(duì)于低濃度的樣品,LAMP的準(zhǔn)確率更高,更適用于臨床檢測(cè)。李明云等[18]根據(jù)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的結(jié)構(gòu)蛋白VP26基因序列,設(shè)計(jì)一套引物,建立了針對(duì)WSSV的LAMP檢測(cè)方法,可檢測(cè)到最低模板濃度為0.563pg/μl,靈敏度比常規(guī)PCR法高1個(gè)數(shù)量級(jí),并且當(dāng)模板濃度由10-5倍稀釋到10-6倍時(shí),PCR產(chǎn)物濃度顯著降低,受模板濃度的影響較大,而LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度則基本不受影響。張侃等[19]將LAMP用于偽狂犬病病毒的檢測(cè),在45min內(nèi)完成檢測(cè),其特異性與PCR方法一致,敏感性則是PCR的100倍,最低能夠檢測(cè)10個(gè)拷貝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL.M.Poon等[20]于2004年首先建立了針對(duì)SARS的RT-LAMP技術(shù),通過(guò)對(duì)31例SARS患者的檢測(cè),檢出率為64%,其靈敏度略低于實(shí)時(shí)PCR,但是比常規(guī)PCR法更高。TetsuoYoneyama等[21]用RT-LAMP法檢測(cè)了糞便中的HAV,實(shí)驗(yàn)中加入了環(huán)引物,將檢測(cè)時(shí)間縮短至50min,與RT-PCR法(需要2~3h)相比大大節(jié)省了時(shí)間;對(duì)HAV實(shí)驗(yàn)室病毒毒株的檢測(cè),靈敏度為0.4~0.8FFU/5μl,與侵染性實(shí)驗(yàn)法相當(dāng),且能檢測(cè)到HAVⅢ型,比real-timeRT-PCR法的檢測(cè)范圍更廣,可作為基層疫情監(jiān)控的常規(guī)檢測(cè)方法。聶凱等[22]采用一步法的RT-LAMP檢測(cè)人甲型H1N1流感病毒基因,在反應(yīng)體系中直接加入反轉(zhuǎn)錄酶,大大簡(jiǎn)化了LAMP技術(shù)用于RNA病毒檢測(cè)的操作步驟。此外,LAMP技術(shù)在檢測(cè)艾滋病病毒[23]、鵝細(xì)小病毒[24]、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒[25]、人星狀病毒[26]、單純皰疹病毒Ⅰ型[27]、豬圓環(huán)2型病毒[28]等方面均有報(bào)道,無(wú)論是DNA還是RNA病毒LAMP都能做到快速檢測(cè),在檢測(cè)RNA病毒時(shí)更是省去了RT-PCR法中費(fèi)時(shí)的反轉(zhuǎn)錄步驟,在臨床檢測(cè)上顯示出越來(lái)越重要的地位。
2.3寄生蟲(chóng)的檢測(cè)HiromiIkadai等[29]將LAMP法用于巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè),證實(shí)LAMP具有與PCR和光學(xué)顯微鏡同樣的敏感性,而且更加簡(jiǎn)便,快速。李群等[30]為提高牛巴貝斯焦蟲(chóng)病的檢出率,采用LAMP法進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,LAMP檢測(cè)體系特異性強(qiáng),與雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA不發(fā)生交叉反應(yīng);敏感性高,最小檢測(cè)值為0.014fg,為一般PCR法的103倍。Jun-HuChen等[31]用LAMP法對(duì)間日瘧感染患者進(jìn)行診斷,在117例鏡檢呈陽(yáng)性的血清樣本中,LAMP檢出115例,靈敏度和特異性與鏡檢法和nestedPCR法相近,但是操作更加簡(jiǎn)單,不需要昂貴的儀器,且對(duì)DNA的抽提要求不高,有望成為檢驗(yàn)科或瘧疾診所的常規(guī)診斷方法。
2.4動(dòng)物胚胎性別的鑒定LAMP在動(dòng)物胚胎性別的鑒定方面也有應(yīng)用,HirokiHirayama等[32]首次利用LAMP法檢測(cè)牛胚胎的性別,鑒定的準(zhǔn)確率為88.9%~94.4%,整個(gè)鑒定過(guò)程不超過(guò)1h。KhairyM.A.Zoheir等[33]也成功將LAMP用于牛胚胎性別的鑒定,以EB和CuSO4為指示劑,反應(yīng)45min即可通過(guò)肉眼觀察顏色的變化,從而鑒定出雌雄,準(zhǔn)確率達(dá)100%,簡(jiǎn)單快速,成本低,可用于養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)操作。
3不足與對(duì)策
3.1存在的不足對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測(cè)時(shí),需要購(gòu)置昂貴的熒光定量PCR儀或濁度儀;LAMP法的擴(kuò)增靶序列長(zhǎng)度控制在300bp以下,對(duì)引物要求高,由在線軟件設(shè)計(jì)的引物有上千條,要篩選出合適的引物需要耗費(fèi)大量的工作;LAMP靈敏度高,一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染;傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的電泳圖都是呈現(xiàn)單帶,而LAMP法陽(yáng)性反應(yīng)則是呈階梯狀條帶,因此,若有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生,則不易辨別,造成LAMP容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
3.2對(duì)策嚴(yán)格做好防污染工作,體系的配制一定要在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)器材要進(jìn)行消毒滅菌;BstDNA酶最后加入體系,若有必要可以在體系上覆蓋一層礦物油;LAMP體系的配制和檢測(cè)必須要嚴(yán)格分區(qū),操作人員往返兩區(qū)域進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)要更換實(shí)驗(yàn)服,同時(shí)要盡可能地避免無(wú)關(guān)緊要的人員流動(dòng),凡進(jìn)入檢測(cè)區(qū)的實(shí)驗(yàn)器材都不要再拿回配制區(qū)。由于開(kāi)蓋檢測(cè)容易造成氣溶膠污染,所以反應(yīng)結(jié)束后最好不要打開(kāi)PCR管,可采用反應(yīng)前加入HNB染料的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。一旦出現(xiàn)污染,應(yīng)立即停止實(shí)驗(yàn),每天給實(shí)驗(yàn)室通風(fēng),給超凈臺(tái)紫外滅菌并通風(fēng),一段時(shí)間后更換所有試劑再做。采用HidenoriTani等[34,35]提出的ABC-LAMP技術(shù)對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行定量,該方法主要是在反應(yīng)體系中加入探針AB-QProbe和已知濃度的內(nèi)標(biāo),探針的熒光值代表靶基因與內(nèi)標(biāo)的比值,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,靶基因與內(nèi)標(biāo)被同等程度擴(kuò)增,通過(guò)測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)兩者的熒光值之比,結(jié)合內(nèi)標(biāo)的初始濃度就能對(duì)初始模板定量,從而實(shí)現(xiàn)了以較低的成本對(duì)產(chǎn)物的定量檢測(cè)。
級(jí)別:統(tǒng)計(jì)源期刊
榮譽(yù):Caj-cd規(guī)范獲獎(jiǎng)期刊
級(jí)別:北大期刊
榮譽(yù):中國(guó)優(yōu)秀期刊遴選數(shù)據(jù)庫(kù)
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