基因工程疫苗精選(九篇)

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第1篇：基因工程疫苗范文

基因工程在醫(yī)學上已得到廣泛應(yīng)用，并且應(yīng)用領(lǐng)域不斷被拓寬，取得了令人驚喜的成就。

1 基因工程制藥

基因工程制藥開創(chuàng)了制藥工業(yè)的新紀元，解決了過去不能生產(chǎn)或者不能經(jīng)濟生產(chǎn)的藥物問題?，F(xiàn)在，人類已經(jīng)可以按照需要，通過基因工程生產(chǎn)出大量廉價優(yōu)質(zhì)的新藥物和診斷試劑，諸如人生長激素、人的胰島素、尿激酶、紅細胞生成素、白細胞介素、干擾素、細胞集落刺激因子、表皮生長因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對性的基因工程蛋白質(zhì)多肽藥物的問世，不僅改變了制藥工業(yè)的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫(yī)治侏儒癥的良藥是人生長激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運用基因工程生產(chǎn)，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們?yōu)榇硕铺祗@的興奮!成本如此之低，又如此之高產(chǎn)，其巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，由此可見。

2 基因工程抗病毒疫苗

為人類抵御病毒侵襲提供了用武之地?；蚬こ桃倚透窝滓呙纭⒖袢∫呙?、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應(yīng)用于臨床，提高了人類對各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問世，使我國新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發(fā)病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”，就是按照人類的設(shè)計，把“生物導彈”發(fā)射出去，精確地命中癌細胞，并炸死癌細胞而不傷害健康的細胞。就單克隆細胞而言，單克隆細胞在腫癌的診斷檢測、顯示定位、監(jiān)測病變、監(jiān)測療效等方面也有重要價值。人類還通過基因工程生產(chǎn)抵御各種病菌、血吸蟲、虐原蟲等疫苗，提高人體對各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世，變革了機體的免疫方式。如今，人們翹首關(guān)注困擾人類的艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)疫苗的早日問世?；蚬こ炭贵w技術(shù)的發(fā)展，為克服單克隆抗體生產(chǎn)細胞株在生產(chǎn)過程中的不穩(wěn)定性，為生產(chǎn)大量高效抗病毒疫苗提供了先進的生產(chǎn)工藝。

3 基因工程治療疾病

臨床實踐已經(jīng)表明，基因治病已經(jīng)變革了整個醫(yī)學的預防和治療領(lǐng)域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病?，F(xiàn)在已知的人類遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運用基因工程技術(shù)或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。人類精心設(shè)計的基因工程操作，克服了不同個體甚至物種之間由于器官移植所產(chǎn)生的免疫排斥作用，實現(xiàn)人體之間的移植已獲成功，成功的實體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯(lián)合移植。而人體與動物之間的器官移植成為現(xiàn)實，臨床應(yīng)用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學合成的完善和自動化，脫氧核糖核酸擴增技術(shù)的優(yōu)化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質(zhì)量，是人類所殷切企盼的?；蛑委熡袃煞N途徑，一是體細胞的基因治療，二是生殖細胞的基因治療。體細胞的基因治療是將正常的遺傳基因?qū)胧芫穆鸭毎麅?nèi)，讓這種遺傳物質(zhì)進入受精卵的基因組內(nèi)，并隨著受精卵分裂，分配到每一個子細胞中去，最終糾正未來個體的遺傳缺陷。而生殖細胞的基因治療是將人類設(shè)計的“目的基因”導入患有遺傳病病人的生殖細胞內(nèi)，此法操作技術(shù)異常復雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無人涉足。

4 基因工程診病

第2篇：基因工程疫苗范文

1. 轉(zhuǎn)基因植物

轉(zhuǎn)基因作物的研究規(guī)模已達到了空前的水平。自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因抗病毒植物誕生以來，轉(zhuǎn)基因作物的研制、中間試驗、田間釋放和商業(yè)化種植得到了迅速的發(fā)展，到1997年底，轉(zhuǎn)基因植物已達幾百種；轉(zhuǎn)基因作物于1986年在美國和法國首次進入大田試驗，到1997年底全世界轉(zhuǎn)基因作物的田間試驗已達25000多例；1994年，美國批準了轉(zhuǎn)基因延熟番茄的商業(yè)化生產(chǎn)，到1997年底，全世界共有51種轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品被正式投入商品化生產(chǎn)。

轉(zhuǎn)基因作物的種植面積正在迅速擴大。全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在1995年僅為1.2×106hm2，1996年為2.84×106hm2，1997年為1.25×107hm2，1998年為2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年進一步增至4.42×107hm2，2001年已達5.26×107hm2.2001年全球轉(zhuǎn)基因作物按作物種類統(tǒng)計為：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按國家統(tǒng)計：美國占70%（面積，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中國占1%～3％，上述4國占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的99%；按目標性狀分類：抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物占77%，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物占15%.據(jù)統(tǒng)計，1999年美國轉(zhuǎn)基因大豆、棉花和玉米的種植面積，分別占該國相應(yīng)作物種植面積的55%、50%和30%。

轉(zhuǎn)基因作物具有巨大的經(jīng)濟效益，1997年美國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積為1×106hm2，平均增產(chǎn)70%，每公頃抗蟲棉可增加凈收益83美元，直接經(jīng)濟效益近1億美元；1998年美國種植轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米達5×106hm2，平均增產(chǎn)9%，其凈收益為68.1美元／hm2，可產(chǎn)生直接經(jīng)濟效益3.4億美元。1995年全球轉(zhuǎn)基因作物的銷售額僅為0.75億美元，1998年達到12億美元～15億美元，2000年已達30億美元，5年間增加了40倍。預計2005年將達60億美元，2010年將達到200億美元。 

2.植物用轉(zhuǎn)基因微生物 

自上世紀80年代以來，重組農(nóng)業(yè)微生物工程研究取得了突破性進展，其中新型重組固氮微生物研究已進入田間試驗，一些殺蟲、防病遺傳工程微生物進入田間試驗或商業(yè)化生產(chǎn)。防凍害基因工程菌株已于1987年進入田間試驗，防治果樹根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亞和美國獲準登記，目前已在澳大利亞、美國、加拿大和西歐一些國家銷售，這是世界上首例商品化生產(chǎn)的植病生防基因工程細菌制劑。具有殺蟲活性的轉(zhuǎn)b.t基因工程細菌，自1991年起已有多個產(chǎn)品進入市場。在高銨條件下仍保持良好固氮能力的耐銨工程菌株，也進入田間試驗。 

3.轉(zhuǎn)基因動物

轉(zhuǎn)基因動物主要應(yīng)用于以下幾個方面：改良動物品種和生產(chǎn)性能；生產(chǎn)人藥用蛋白和營養(yǎng)保健蛋白；生產(chǎn)人用器官移植的異種供體；建立疾病和藥物篩選模型；生產(chǎn)新型生物材料等。1998年全球動物生物技術(shù)產(chǎn)品總銷售額約為6.2億美元，預計2010年總銷售額將達到110億美元，其中75億美元是轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品。

4. 獸用基因工程生物制品

獸用基因工程生物制品是指利用重組dna技術(shù)生產(chǎn)的獸用免疫制劑。主要包括：單克隆抗體等診斷試劑，目前國內(nèi)外正在研究、開發(fā)或已應(yīng)用的單克隆抗體診斷試劑已達1000多種；基因工程疫苗，已有44例獲準進行商品化生產(chǎn)，其中重組亞單位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重組活疫苗2例。此外，還有dna疫苗和獸用基因植物源生物制品等。 

5. 轉(zhuǎn)基因水生生物 

迄今為止，全世界研究的轉(zhuǎn)基因水生生物達20余種，已有8種進入中間試驗，其中我國有一種兩例，僅有大西洋鮭1種可能已開始小規(guī)模商品化生產(chǎn)。

6. 我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)化概況

我國轉(zhuǎn)基因植物的研究開發(fā)始于20世紀80年代，1986年啟動的863高新技術(shù)計劃起到了關(guān)鍵性的導向、帶動和輻射作用。據(jù)1996年統(tǒng)計，國內(nèi)正在研究和開發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物約47種，涉及各類基因103種。1997年～1999年，有26例轉(zhuǎn)基因植物獲準進行商業(yè)化生產(chǎn)。按轉(zhuǎn)基因性狀分：抗蟲16例，抗病毒9例，改良品質(zhì)1例。按作物劃分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牽牛1例。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是國內(nèi)植物基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的第一個成功范例，使我國成為繼美國之后獨立研制成抗蟲棉，并具有自主知識產(chǎn)權(quán)的第二個國家。1998年～2001年4年累計種植逾1.3×106hm2，減少農(nóng)藥使用量70%以上，產(chǎn)生了巨大的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益。由于其傘形輻射的帶動作用，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、楊樹等一批后繼轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品正在進行田間試驗，蓄勢待發(fā)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將使農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)生深刻的結(jié)構(gòu)變化，向農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)與食品、農(nóng)業(yè)與加工結(jié)合的方向發(fā)展。

我國植物用轉(zhuǎn)基因微生物研究已取得長足進展，正在研發(fā)的防病殺蟲微生物13種，涉及基因16種；固氮微生物8種，涉及基因12種，大多已進入中間試驗和環(huán)境釋放試驗。我國獸用基因工程生物制品研究與產(chǎn)業(yè)化進展迅速，已有近70種單克隆抗體等診斷試劑投放市場，2例基因工程疫苗獲準進行商品化生產(chǎn)，其中重組亞單位疫苗1例，基因重組活疫苗1例。

我國轉(zhuǎn)基因水生生物研究取得了舉世矚目的成就，1985年，我國培育出世界首批轉(zhuǎn)基因魚。此后，培育出比正常生長速度快3倍～4.6倍的轉(zhuǎn)基因泥鰍。目前，轉(zhuǎn)生長激素基因鯉、轉(zhuǎn)大馬哈魚生長激素基因鯉均進入中試階段。此外，我國還開展了藻類、貝類等其他水生生物的轉(zhuǎn)基因研究。我國轉(zhuǎn)基因動物研究成績斐然，生長速度快、瘦肉率高、對某些病毒有一定抗性的轉(zhuǎn)基因豬培育成功，乳腺組織能夠表達人藥用蛋白凝血因子ix、人生長激素、人紅細胞生成素的轉(zhuǎn)基因羊已進入中試和安全性評價階段，此外，還成功地培育了轉(zhuǎn)基因牛。

第3篇：基因工程疫苗范文

【Abstract】 AIM: To design and obtain novel rotavirus (RV) VP6 gene. METHODS: On the basis of our previous reports， RV VP6 gene was optimized through the gradual splicing method， according to the improved PCR strategy. RESULTS: The optimized cDNA sequence of RV VP6 gene was successfully synthesized， which was about 1220 bp and reached 55% in (G+C) content. CONCLUSION: The optimized RV VP6 gene was obviously increased about 20% in (G+C) content compared to wildtype RV VP6 gene. This study laid a further strong foundation for the development of novel oral rotavirus genetic engineering vaccine.

【Keywords】 rotavirus; VP6 gene; genes， synthetic; genetic engineering vaccine

【摘要】 目的：設(shè)計獲得輪狀病毒（RV）新型VP6基因. 方法：本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，對RV VP6基因的優(yōu)化合成方法進行了探索研究. 我們應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優(yōu)化改造. 結(jié)果：成功地合成了優(yōu)化的RV VP6基因cDNA序列，該序列長約1220 bp，(G+C)含量達55%. 結(jié)論：與野生型RV VP6基因相比，優(yōu)化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了約20%，這一工作為新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基礎(chǔ).

【關(guān)鍵詞】 輪狀病毒； VP6基因；基因，合成； 基因工程疫苗

0引言

輪狀病毒（rotavirus， RV）是引起全世界嬰幼兒嚴重腹瀉的重要病原，RV危害嚴重且無有效的治療手段［1］，根除RV感染的惟一途徑是發(fā)展安全、有效的疫苗，這已成為一個全球性的公共醫(yī)療目標，是一項十分迫切而必要的工作［2-5］. A組RV血清型眾多，VP6蛋白是其主要的組特異性抗原，有較強的抗原性和免疫原性，可誘導保護性免疫. 有研究表明，VP6蛋白的IgA mAb對RV感染具有免疫保護作用，肌注免疫VP6 DNA疫苗可產(chǎn)生較好的異源保護作用［6］，以VP6蛋白和黏膜佐劑免疫小鼠可誘導產(chǎn)生對鼠RV EDIM株的完全保護作用［7］. 根據(jù)我國RV的感染狀況，本課題組的疫苗設(shè)計方案主要包括A組RV的VP6抗原和A組RV G1，G2和G3型3種不同的VP7抗原. 前期免疫效果研究結(jié)果表明，灌胃免疫組產(chǎn)生的RV特異性免疫反應(yīng)較滴鼻組弱，推測可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫效果弱化有關(guān). 據(jù)此，為了發(fā)展新型高效的口服RV基因工程疫苗，我們應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優(yōu)化合成研究，以期提高其(G+C)含量，可望增加其表達量和提高以其為目標抗原的RV疫苗的免疫效果.

1材料和方法

1.1材料PcDNAⅡ質(zhì)粒，E.coli DH5α菌種和E.coli DH10B菌種均為本室保存. Agarose Gel DNA purification Kit， Pyrobest DNA polymerase，T4 DNA Ligase， 限制性DNA內(nèi)切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XGal， IPTG， DNA Marker DL2000， dNTP mixture和Amp均為Takara產(chǎn)品；RNA酶為Sigma產(chǎn)品； 酵母提取物和胰蛋白胨為OXOID產(chǎn)品； PEG(4000)為Promega產(chǎn)品.

1.2方法

1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.2.2RV VP6基因的優(yōu)化合成根據(jù)RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，重新設(shè)計了RV VP6基因的重組cDNA序列，合成了引物P11～P116和P21～P216與sP115和sP216. 根據(jù)嵌套式PCR方法制備突變體的原理［8］，我們應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列.

2結(jié)果

2.1RV VP6基因S1和S2片段的合成應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列，RV VP6基因全長S片段分為S1和S2片段兩部分先分別合成，再以S1和S2片段為模板，合成RV VP6基因全長S片段，合成策略見圖1，2. 獲得RV VP6基因S1和S2片段（圖3，4），對其進行酶切和測序鑒定（圖5，6），合成片段序列正確.

2.2獲得優(yōu)化的RV VP6基因全長S片段逐步拼接法獲得了約1220 bp的RV VP6基因全長目的片段（圖7），進行酶切（圖8）和測序鑒定，目的片段序列正確.

1: RV VP6基因全長S片段；2: DNA標準DL2000.

圖7RV VP6基因全長S片段的PCR產(chǎn)物

1: DNA標準DL2000；2: RV VP6基因全長S片段陽性重組質(zhì)粒.

圖8RV VP6基因全長S片段陽性重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3RV VP6基因優(yōu)化改造前后的序列對比分析應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法成功地優(yōu)化合成了RV VP6基因. 與優(yōu)化改造前的野生型序列相比，優(yōu)化后的RV VP6基因(G+C)含量提高了約20％. 優(yōu)化改造前后的序列對比和(G+C)含量分析見表1.表1RV VP6基因優(yōu)化改造前后的序列對比分析

轉(zhuǎn)貼于 3討論

國內(nèi)外新型病毒疫苗發(fā)展規(guī)劃將RV預防性疫苗列為新型病毒疫苗研制的重點項目之一，全球疫苗與免疫接種聯(lián)盟（GAVI）和WHO也十分重視中國的口服RV活疫苗，將其列為“全球疫苗腹瀉病控制和免疫規(guī)劃”主攻發(fā)展的首要疫苗. 為了發(fā)展新型高效的口服RV基因工程疫苗， 本研究在前期免疫效果研究工作的基礎(chǔ)上， 針對灌胃免疫組產(chǎn)生的RV特異性免疫反應(yīng)比滴鼻組弱的問題，分析其原因可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫原性弱化有關(guān)，根據(jù)有關(guān)HIV和DNA序列化學合成的有關(guān)研究報道［9-17］，提高目的基因的(G+C)含量可顯著提高其表達量，從而增強其免疫效果. 據(jù)此，我們對RV VP6基因優(yōu)化合成方法進行了探索研究. 根據(jù)RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，我們重新設(shè)計了RV VP6基因的cDNA序列，并增加了有助序列正確翻譯的Kozak序列，以提高VP6的表達量. 優(yōu)化改造的VP6基因重組cDNA序列包含保護性堿基、酶切位點和Kozak序列，共計約1220 bp.

應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因的人工合成方法進行探索，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用改良的嵌套式PCR策略合成基因時，具體合成方法（逐步拼接法或兩步法）的選擇及基因合成的成功率可能主要取決于引物長度及其彼此間的重疊長度. ①當引物長度

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第4篇：基因工程疫苗范文

各位老師、各位領(lǐng)導：

大家下午好！

我叫榮俊，是生命科學學院的一名普通教師。今天有機會站在這里，主要是與大家進行交流，分享一下從事科研工作的體會。

今年1月10日，我在北京參加了2013年度國家科學技術(shù)獎勵大會，我參與的一個項目獲得了國家技術(shù)發(fā)明二等獎。

這個項目名稱叫《傳染性法氏囊病的防控新技術(shù)構(gòu)建及其應(yīng)用》，是由浙江大學、長江大學、北京市農(nóng)林科學院、青島易邦生物工程有限公司共同完成的。長江大學是第二完成單位。作為主要完成人，我排名第三，動物科學學院的程太平副教授排名第六。

算起來，進行這個項目的研究，前前后后已有20多年。項目組在“863”“科技支撐”“973” 等計劃項目的持續(xù)資助下，構(gòu)建了傳染性法氏囊病病毒（IBDV）反向遺傳學技術(shù)平臺，揭示了傳染性法氏囊病病毒的基因重配和復制的機制，發(fā)展了具有國際領(lǐng)先水平的安全的傳染性法氏囊病新型疫苗、檢測技術(shù)體系，尤其是發(fā)明的基因工程亞單位疫苗在養(yǎng)雞生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，為減少疫病發(fā)生、消除傳染性法氏囊病病毒變異、凈化雞場的傳染性法氏囊病作出了重大貢獻。

作為成果第三完成人，我主持了雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的研究，組織實施了傳染性法氏囊病毒VP2 基因改造、基因表達、表達產(chǎn)物純化、油乳劑疫苗生產(chǎn)工藝研究，動物實驗研究，獲得了國家授權(quán)發(fā)明專利、農(nóng)業(yè)部簽發(fā)了國家II類新獸藥注冊證書和準予生產(chǎn)產(chǎn)品批準文號、獲得國家重點新產(chǎn)品證書1 個。

尤其值得欣慰的是，我的發(fā)明專利技術(shù)在青島易邦生物工程有限公司得到了具體實施和應(yīng)用，作為國家重點新產(chǎn)品，該疫苗已連續(xù)生產(chǎn)5年并在全國除香港和澳門所有省、市、自治區(qū)推廣使用，實現(xiàn)銷售收入4.776 億元，新增利稅收2.134億元。目前本成果產(chǎn)品的國內(nèi)市場份額達到70%以上。

回顧我的科研歷程，我覺得，有幾點感受較深的體會，在此與大家分享。

第一，科研成果的獲得是大量時間和精力投入的結(jié)果。

記得黨委書記朱業(yè)宏來看我時我曾經(jīng)說過一句話，我絕對不是長江大學做科研中最聰明的和最有水平的，但我肯定是最勤奮的。以這次獲獎項目的研究過程為例：傳染性法氏囊病基因工程疫苗的研究，1999年立項，2000年經(jīng)費到賬后進行理論研究和前期準備。從2001年到項目通過鑒定這4年時間里，我的工作時間是每年360天。沒有節(jié)假日和星期天，每年春節(jié)后一般都是初二或初三去實驗室工作。經(jīng)常是我到實驗室了，管門房的工人還沒有起來開門。

第二，不要抱怨自己所在單位的條件不好，充分利用現(xiàn)有試驗設(shè)備和試驗條件你一定會獲得成功。將普通設(shè)備用好也是一種創(chuàng)新。

我們有很多新教師和老教師習慣報怨單位沒有好的研究條件，其實好多人都沒有真正了解自己試驗室有些什么東西，能做什么。其實這是一種缺乏進取心、自我解壓的心理表現(xiàn)。其實在我的研究早期是沒有什么試驗設(shè)備的。當時有不少同事挖苦我要在湖北農(nóng)學院研究基因工程疫苗，認為這是不可能的事。我們做基因工程疫苗抗原蛋白的表達必須做western blot，而我們實驗室沒有轉(zhuǎn)膜電泳槽，我就根據(jù)在武漢大學用過的儀器構(gòu)造和原理，拆下報廢電泳槽上的鉑金絲自己制作了一個轉(zhuǎn)膜電泳槽，用我自制的設(shè)備做的實驗非常成功。用這個設(shè)備做的western blot 照片在2篇SCI論文（3.0以上）中應(yīng)用。

在青島易邦公司做工藝時，要增加一步去內(nèi)毒素的工藝，公司的員工要去買冷凍離心機，每臺需大約45萬元。我?guī)退麄冊O(shè)計了一個可放置5個5升分液漏斗可移動操作臺，可以在冷庫和操作間移動。每個臺架加分液漏斗可相當兩臺離心機。而每個臺架的造價不到1000元。易邦的老總感嘆道，現(xiàn)在年輕的研究人員只知道現(xiàn)代化的設(shè)備，對那些管用又便宜的玻璃儀器一無所知。像這樣的例子在我的科研實踐中還有不少。

第三，國家的需求社會的需求是科研選題的最重要標準。

上世紀末和本世紀初正是我國動物疫苗生產(chǎn)由傳統(tǒng)疫苗向現(xiàn)代新型疫苗轉(zhuǎn)型的初期。人類醫(yī)藥中乙型肝炎病毒基因工程亞單位疫苗成功研制和應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。在獸醫(yī)中還沒有一個叫得響的產(chǎn)品，與我們前后同時進入新藥申報的基因工程疫苗有：復旦大學的豬口蹄疫病毒基因工程亞單位疫苗，西南農(nóng)大的豬偽狂犬病基因缺失疫苗。這兩個疫苗因為免疫效果不佳沒有能推廣開。其中復旦大學的疫苗轉(zhuǎn)讓給內(nèi)蒙古金宇集團后基本沒有生產(chǎn)。從特定疫苗生產(chǎn)的專業(yè)角度更是急需的產(chǎn)品。我們的產(chǎn)品是在產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵時期推出的，是國家和社會急需的東西。2011年春天，我到荊門十里鋪去買雞做實驗，我特地問了一下養(yǎng)雞戶，你們免疫傳染性法氏囊病用什么疫苗，他們告訴我他們附近的養(yǎng)殖戶都用青島易邦的疫苗，效果非常好，免疫后基本上都可以不患法氏囊病。他們不知道我是該疫苗的發(fā)明者。聽到這樣的評價我真正有了成就感。

第四，千萬不要迷信文獻資料和專家權(quán)威。

從1990年起就有國外的論文報道用原核生物表達傳染性法氏囊病毒VP2蛋白做疫苗是行不通的。我們的研究真真切切的讓這種不可能變?yōu)榱丝赡?。在我們進行新藥申報的過程中也曾有國內(nèi)的頂級專家提出質(zhì)疑，其理由就是兩個：一是國外權(quán)威雜志的論文和結(jié)論；二是他們自己做過沒有成功。所以專家權(quán)威不可全信。

華中農(nóng)大的陳煥春院士知道我們這個產(chǎn)品后，對他們試驗室的博士們發(fā)出感慨道，榮老師在長江大學做的產(chǎn)品賣到易邦去了（因為易邦公司在國內(nèi)是排第二的獸藥企業(yè)）。所以作為長江大學人要有我們的自信。

第五，成功的最關(guān)鍵時刻是咬緊牙再堅持一會。

在該項目的研究中有兩次令人崩潰的時候。第一次是獲取目的基因，由于病理樣本中病毒數(shù)太少，加上當時缺乏經(jīng)驗，實驗基本上是按書本來做。當時相同的工作反復做了10個月。反轉(zhuǎn)錄，PCR，電泳，轉(zhuǎn)化，鑒定。每星期重復2-3次，最后終于取得了正確的基因。第二次是在青島易邦做工藝時，遇上了副反應(yīng)的問題。這種問題在試驗室比較不明顯，在免疫的局部出現(xiàn)核桃大小的結(jié)蒂組織增生。那時是三個星期一個輪回，制苗，免疫，剖檢。反復改進工藝和疫苗配比，經(jīng)過11個月完成了工業(yè)生產(chǎn)工藝流程。

說完這些科研體會，我還想說一下感恩，做人必須常懷感恩之心。說實話，我真心感謝原農(nóng)學院和現(xiàn)在的長江大學，為我提供了展示自己的舞臺。

感謝原湖北農(nóng)學院為我提供了當時院內(nèi)最高的資助，8萬元。正是湖北省科技廳的2萬元加上湖北農(nóng)學院的8萬元使我能夠完成該項目。我現(xiàn)在是不差錢，但在當時這點錢是甘露。

感謝易邦公司的老總，杜元釗總經(jīng)理，在兩次巨額賠款后仍然對該產(chǎn)品充滿信心。2次賠了300多萬。

感謝生科院給了我相對比較寬松的環(huán)境和條件。

感謝動科院在我離開學院后還能為我敞開試驗室。

感謝朱業(yè)宏書記親臨看望，使我這個一線的科研人員深切地體會到了組織的關(guān)懷和溫暖。

第5篇：基因工程疫苗范文

摘要：近年來，基因工程技術(shù)廣泛應(yīng)用于馬鈴薯抗病、抗菌、抗蟲、抗除草劑、品質(zhì)改良及生物反應(yīng)器的研究中并取得了一定進展。本文綜述了近20年國內(nèi)外基因工程在馬鈴薯育種上的應(yīng)用現(xiàn)狀，為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：基因工程；馬鈴薯育種；應(yīng)用現(xiàn)狀

中圖分類號：S532.035.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0130-04

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界上廣為種植的糧、菜、飼兼用型作物，也是我國干旱和半干旱地區(qū)重要的經(jīng)濟作物，可以加工制成各種產(chǎn)品[1]，其栽培面積僅次于小麥、水稻和玉米。全世界每年的總產(chǎn)量將近3×108 t，中國占了其中的18%，居世界第一位[2]。馬鈴薯以其獨特的經(jīng)濟價值受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，尤其近年來隨著生物能源的興起與開發(fā)，馬鈴薯也被視為一種新型的能源材料，從而掀起了對馬鈴薯生物學性狀及應(yīng)用的研究熱潮[3]。

馬鈴薯為同源四倍體作物，其遺傳分離復雜、后代篩選繁瑣，用常規(guī)育種方法改良品種難度極大。盡管已培育出許多食用加工的優(yōu)良品種，但至今許多優(yōu)良栽培品種仍受到多種病蟲害等的嚴重危害。近些年發(fā)展起來的植物基因工程技術(shù)，可以將各種來源的基因?qū)腭R鈴薯，使馬鈴薯基因工程取得了許多突破，顯示出誘人的前景。

1 馬鈴薯抗病基因工程

11 馬鈴薯抗病毒病基因工程

病毒病是馬鈴薯的主要病害之一，也是造成馬鈴薯退化的主要原因，嚴重危害著我國馬鈴薯的生產(chǎn)。隨著病毒檢測技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有馬鈴薯品種都受到一種或幾種病毒的侵染[4]。目前已報道的侵染馬鈴薯的病毒有40余種[5]，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的專門寄生于馬鈴薯的就有9種，即馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯M病毒（PVM）以及馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）[6]。其中馬鈴薯Y 病毒和馬鈴薯卷葉病毒是最主要的馬鈴薯病毒[7]。而且PVY+PVX或PVY+PLRV混合侵染帶來的損失遠遠大于各病毒單獨侵染。

馬鈴薯抗病毒基因工程主要有病毒外殼蛋白（CP）基因的交叉保護作用，RNA和反義RNA介導的抗性，核酶、缺損的復制酶基因介導的抗性以及干擾運動蛋白等[8]。在以上技術(shù)中， 利用病毒外殼蛋白基因介導植物產(chǎn)生抗病性是目前馬鈴薯抗病毒基因工程的熱點之一。近十多年來，應(yīng)用生物工程技術(shù)將病毒外殼蛋白（CP） 基因?qū)腭R鈴薯的研究工作已取得重要進展[9]，有些學者鑒定了表達PVX+PVY雙價CP基因轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗病性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對PVX+PVY復合感染產(chǎn)生不同程度的抗性[10]。利用反義RNA技術(shù)，有些學者用非翻譯的序列轉(zhuǎn)化植株也能產(chǎn)生抗性，RNA與反義RNA轉(zhuǎn)化阻礙翻譯的進行，導致基因產(chǎn)物減少[11]。馬鈴薯抗病毒基因工程的成果還有很多，隨著對病毒與植物相互作用機理的深入研究，抗病毒基因工程在育種上將會發(fā)揮更大的作用。

12 馬鈴薯抗真菌病基因工程

真菌性病害也是限制馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，馬鈴薯真菌病害種類繁多，其中最主要的是晚疫病菌（Phytophthora infestans），往往造成馬鈴薯大幅度減產(chǎn)。近年來通過基因工程技術(shù)在馬鈴薯抗真菌病方面取得一定的進展。在馬鈴薯抗真菌病基因工程育種中大量使用的主要有植物病程相關(guān)蛋白、水解酶——幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶、抗真菌蛋白（肽）、抑制病原菌毒性因子的蛋白等等。付道林等[12]將攜帶有Ⅰ型煙草β-1，3-葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆幾丁質(zhì)酶基因的pBLGC質(zhì)粒導入津引8號馬鈴薯品種中，獲得了抗病轉(zhuǎn)基因品種。Ali等[13]將人工合成的4種陽離子肽基因?qū)腭R鈴薯并對馬鈴薯病原真菌和細菌的抗菌活性進行了測試，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株對相應(yīng)病原菌的抗性都得到一定程度的增強。

13 馬鈴薯抗細菌病基因工程

近年來植物抗細菌病基因工程研究取得的進展，主要表現(xiàn)在阻斷病原細菌的致病途徑，強化植物抗病反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導途徑，植物防御基因的表達，利用非植物源抗菌蛋白和利用細胞凋亡反應(yīng)控制病害的發(fā)生等方面。Dong等[14]將克隆于芽孢桿菌的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）水解酶基因aiiA轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯，轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯對軟腐病菌（Erwinia carotovora）的抗性顯著提高。賈士榮等[15]將人工合成的Cecropin B及Shiva A基因轉(zhuǎn)入我國7個馬鈴薯主栽品種中，經(jīng)溫室和田間接種試驗鑒定，部分轉(zhuǎn)基因材料對青枯病的抗性比對照提高1～3級。

2 馬鈴薯抗蟲基因工程

在馬鈴薯的整個生育期，常常遭受各種害蟲的侵襲，如蚜蟲、馬鈴薯塊莖夜蛾、蠐螬等，直接危害地上與地下部分，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至導致死亡。迄今為止，各國研究人員已經(jīng)利用基因工程技術(shù)分離得到了不同來源的抗蟲基因，其中用于提高植物抗蟲性的主要有兩類：一類是從細菌中分離出來的抗蟲基因，如蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Bt基因）；另一類是從植物中分離出來的抗蟲基因，如蛋白酶抑制劑基因（PI基因）、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中，Bt基因和PI基因在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最廣[16]。Arpaia等[17]的研究結(jié)果表明，雌性科羅拉多甲蟲取食了含有cry3B的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后，生殖能力受到了嚴重損害，不能產(chǎn)生后代。Marchetti等[18]從大豆中分離得到了幾種蛋白酶抑制劑基因（KTi3、C-Ⅱand PⅠ-Ⅳ），并將其導入馬鈴薯中，經(jīng)檢測在表達足夠數(shù)量抑制劑的情況下，幼蟲重量的增加降低50%。

3 馬鈴薯抗除草劑基因工程

通過化學方法控制雜草已成為現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一部分，但除草劑在殺死雜草的同時不僅污染環(huán)境，有的還會對農(nóng)作物的生長產(chǎn)生傷害。而通過基因工程技術(shù)將耐除草劑基因?qū)胱魑?，增加了對除草劑的選擇性和安全性[19]。耐除草劑基因工程主要從兩個方面解決問題，一是修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感，或使其過量表達讓植物吸收除草劑以后仍能進行正常代謝；二是引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前降解或解毒。如比利時植物遺傳部門的研究人員把編碼乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的Bar基因?qū)腭R鈴薯，獲得耐除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。

4 馬鈴薯抗逆基因工程

干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等逆境條件影響馬鈴薯生長，嚴重時甚至導致死亡。隨著分子生物學的發(fā)展，研究者從基因組成、表達調(diào)控及信號傳導等方面進行深入研究，明確植物對逆境脅迫的耐（抗）性機理，將相關(guān)基因?qū)腭R鈴薯以改良脅迫抗性。例如，Goddijn等[20]成功地將大腸桿菌海藻糖合成酶基因復合體otsAB基因?qū)腭R鈴薯，明顯提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。趙映琴[21]將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯株系中，在相同鹽濃度脅迫下，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的株高明顯高于對照，尤其是在高鹽條件下脅迫90 d時，大部分轉(zhuǎn)基因株系的株高均顯著高于對照。

5 馬鈴薯加工品質(zhì)改善基因工程

51 馬鈴薯淀粉品質(zhì)改良基因工程

在淀粉的生物合成過程中，影響淀粉品質(zhì)的關(guān)鍵酶是淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase），它們共同作用影響淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)和特性。利用基因工程手段改變這些酶在植物中的表達，從而獲得具有獨特性質(zhì)、新型的馬鈴薯淀粉用于食品加工或其它工業(yè)生產(chǎn)之中。宋波濤等[22]通過根癌農(nóng)桿菌介導法將CaMV35S驅(qū)動的正/反義sAGP基因?qū)腭R鈴薯后，轉(zhuǎn)正義sAGP基因的淀粉含量增加5%～6%，而轉(zhuǎn)反義sAGP基因淀粉含量下降達27%。在馬鈴薯中，AGPase水平降低時，直鏈淀粉含量顯著降低，而支鏈淀粉含量升高[23]。

52 馬鈴薯塊莖抗褐變基因工程

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是產(chǎn)生褐變現(xiàn)象的主要原因。許多研究者運用反義RNA技術(shù)特異抑制PPO的表達，從而達到抑制馬鈴薯褐化的目的。如Bachem等[24]將反義多酚氧化酶基因?qū)腭R鈴薯，能夠有效增強塊莖的抗褐變能力。

53 馬鈴薯塊莖抗低溫糖化基因工程

據(jù)資料介紹，塊莖在低溫貯藏條件下的低溫糖化給馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)帶來的損失高達數(shù)千萬美元。于是，人們借助基因工程技術(shù)來解決這一難題。張金文[25]克隆了馬鈴薯栽培品種“甘農(nóng)薯1號”的酸性轉(zhuǎn)化酶基因，構(gòu)建了反義植物表達載體，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。除了運用反義RNA技術(shù)外，還可通過表達自身或外源的酸性轉(zhuǎn)化酶抑制因子來改善馬鈴薯低溫糖化。如超量表達煙草酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子的馬鈴薯在4℃低溫貯藏后塊莖中的還原糖含量與液泡酸性轉(zhuǎn)化酶的活性都顯著降低，兩者呈正相關(guān)[26]。張瓊[27]用低溫誘導塊莖特異表達融合啟動子pCL與pCLMlb的反義轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果酸性轉(zhuǎn)化酶的活性顯著降低，進而引起還原糖含量不同程度的下降。

6 馬鈴薯生物反應(yīng)器基因工程

馬鈴薯作為生物反應(yīng)器的基因工程主要有：利用馬鈴薯生產(chǎn)疫苗、植物抗體、蛋白質(zhì)多肽藥物、糖類物質(zhì)、工業(yè)可降解塑料的原料及可降解生物塑料等。Zhang等[28]利用農(nóng)桿菌介導將人免疫缺陷Ⅰ型病毒 HIV-1p24蛋白插入馬鈴薯基因組，葉片中的表達量為35 mg/g。李晉濤等[29]報道，將人源輪狀病毒（RV）轉(zhuǎn)入馬鈴薯，并用小鼠口服該轉(zhuǎn)基因植株進行免疫應(yīng)答研究，結(jié)果顯示，人源輪狀病毒轉(zhuǎn)基因植物疫苗聯(lián)合黏膜佐劑免疫動物可誘導特異的系統(tǒng)與黏膜免疫應(yīng)答，且黏膜免疫強度略高于系統(tǒng)免疫。謝安勇等[30]利用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，從真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16染色體DNA中擴增并克隆了調(diào)控PHB生物合成的phbB和phbC基因；雍偉東等[31]將多聚β-羥基丁酸酯（PHB）合成過程中所需的2種酶phbB和phbC的編碼基因轉(zhuǎn)入到馬鈴薯體內(nèi)，并采用特定的啟動子使這些基因的編碼蛋白最后定位在細胞的葉綠體中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中PHB干物質(zhì)的含量可以達到0025～1800 g/kg，并且這些外源基因的表達并不影響馬鈴薯的生長和育性。

7 前景展望

馬鈴薯基因工程育種在短短十幾年中已取得了豐碩成果，其在抗蟲、抗病、抗逆等方面具有傳統(tǒng)育種和生產(chǎn)無法比擬的優(yōu)越性，提高了對病蟲的抵抗和防御能力，增強了對干旱高鹽的適應(yīng)性，并能減少化學農(nóng)藥的使用量及保護生態(tài)環(huán)境，為培育馬鈴薯優(yōu)良品系開辟了一條嶄新的道路。同時，作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人們所需要的大量疫苗和藥物，可供人類和家畜直接使用，便捷可靠。但是，目前馬鈴薯基因工程還受許多因素的制約，如轉(zhuǎn)基因效率低和轉(zhuǎn)基因生物安全性等問題。為了更好地發(fā)展和應(yīng)用這項技術(shù)，在今后的研究中應(yīng)著重解決以下問題：首先繼續(xù)發(fā)現(xiàn)新型、高效基因，并研究其機制；其次應(yīng)加強研究目的基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳、表達穩(wěn)定性；且深入研究基因抗性的機制并制定確實有效的反抗性措施。盡管還存在許多有待進一步解決的問題，但應(yīng)該看到，馬鈴薯基因工程的發(fā)展速度是非常快的，其應(yīng)用前景十分廣闊。參 考 文 獻：

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第6篇：基因工程疫苗范文

家長們都知道孩子進行疫苗接種非常重要，可是疫苗有哪些種類？什么是減毒活疫苗？計劃外的疫苗要不要接種？如何正確認識接種后的疫苗反應(yīng)？疫苗接種有什么禁忌癥？對此，我們要科普一下。

兒童疫苗接種程序中包含減毒活疫苗、滅活疫苗和基因工程疫苗。減毒活疫苗，顧名思義是將某種病原（細菌或病毒）傳代培養(yǎng)，將其致病毒力減到很低的程度，只刺激免疫反應(yīng)，不會使人發(fā)?。粶缁钜呙缇褪怯眉兹┑葘⒉≡瓪⑺?，但是仍保留其抗原性，但絕對沒有致病力；基因工程疫苗是利用基因工程技術(shù)提取病原體的抗原成分制成疫苗，根本不是病原本身。

那么具體的疫苗有哪些種？接種程序中減毒活疫苗有：卡介苗、口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙型腦炎疫苗、麻風腮疫苗、水痘疫苗、流行性腦膜炎球菌疫苗、輪狀病毒疫苗。滅活疫苗有：百白破疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗（HIB）、注射脊髓灰質(zhì)炎疫苗、肺炎球菌疫苗。基因工程疫苗有乙肝疫苗和甲肝疫苗。計劃外疫苗要不要接種呢？社區(qū)疫苗接種中心能夠提供的自費疫苗有很多種，要根據(jù)兒童自身健康情況加以選擇。但是在歐美等發(fā)達國家和一些國際醫(yī)療中心，已經(jīng)普遍開始建議家長為寶寶接種HIB疫苗、肺炎球菌疫苗、輪狀病毒疫苗、水痘疫苗等。

HIB疫苗是小兒肺炎、小兒腦膜炎的克星，該疫苗已被世界上20多個國家列入常規(guī)計劃免疫接種范圍。由于中國國內(nèi)普遍存在抗生素濫用的現(xiàn)象，使得細菌對抗生素的耐藥性上升，感染后比較難診治。所以，5歲以下，尤其是兩個月到兩歲的嬰幼兒應(yīng)在醫(yī)生監(jiān)督下接種。

常見的接種反應(yīng)有發(fā)熱，局部注射部位紅腫熱痛，皮疹，精神不振，嗜睡，食欲減退，嘔吐，腹瀉等。上述不良反應(yīng)常發(fā)生在疫苗接種后頭兩天，持續(xù)1～2天后發(fā)熱及其他癥狀將相繼消失。

值得注意的是，社區(qū)接種的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，也就是我們常說的糖丸，是減毒活疫苗。有的家長在孩子服用糖丸后喂溫熱水，會影響體內(nèi)抗體的產(chǎn)生，極個別情況下還會出現(xiàn)口服糖丸后感染小兒麻痹癥的病例。國際上推薦使用的是滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，是注射劑型，接種后絕對不會感染小兒麻痹癥，安全性更高。

正在發(fā)熱，特別是高熱或伴有明顯的全身不適的急性癥狀時，應(yīng)暫緩接種疫苗，以免接種后加劇發(fā)熱性疾病。帶兒童接種疫苗前，家長需要觀察兒童的健康狀況。

如果兒童身體不適或與平時表現(xiàn)異常，如突然食欲不佳、咳嗽、異常的哭鬧，家長應(yīng)推遲疫苗接種時間。除了接種疫苗前須先就診，家長還須主動與護士一同檢查疫苗的包裝是否完整，核對疫苗的名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期，在確保以上信息正確無誤的情況下再接種疫苗，保障孩子的安全。

器官有性別

最新的研究表明，我們的身體除了性器官，其他的器官也存在著性別的差異。我們的器官可能是“男性”或“女性”的，這可能意味著女性和男性在疾病治療的過程中需要區(qū)別對待。這個研究還可以解釋為什么有些癌癥多見于女性，而其他則多見于男性。這項研究發(fā)表在《Nature》雜志上，由英國倫敦國王學院臨床醫(yī)學中心（CSC）的科學家在果蠅中進行研究。

CSC團隊檢查了果蠅腸道干細胞。他們使用的遺傳學工具，使他們能夠打開或者關(guān)閉這些細胞中的某些基因。這允許他們改造這些干細胞變得更“雌性化”或者更“雄性化”。然后他們試圖擴增這些細胞。他們發(fā)現(xiàn)，“雌性化”的細胞能更好地增殖。

這種增強的能力似乎允許雌蠅在繁殖期間腸道的增長。先前的研究已經(jīng)表明，后，雌蠅腸道尺寸重新調(diào)整，和改變代謝來維持再生產(chǎn)。在目前的研究中，研究小組發(fā)現(xiàn)，“雌性化”的腸道干細胞的影響是可逆的。取出雌果蠅腸道干細胞并將其“雄性化”改造，三周后發(fā)現(xiàn)，這些細胞出現(xiàn)“雄性化”的傾向，細胞會變小。

該小組還發(fā)現(xiàn)，雌性腸道更容易出現(xiàn)腫瘤。他們對此的解釋是，因為在雌性中腸道需要在繁殖期有一定的可塑性，這也導致了其更容易遭受癌細胞侵襲。據(jù)了解，脊椎動物的性腺或性器官保留相當?shù)目伤苄裕撼赡曷殉埠偷募毎谛∈篌w內(nèi)可以轉(zhuǎn)分化為其相反性別的細胞，而只需要單一的基因變化。所以性腺細胞必須在胚胎出生后不斷強化自己的性別特征。

這是第一次證明了性腺外成年細胞被證明有著性別可塑性。在這個研究過程中，研究小組發(fā)現(xiàn)這種性別轉(zhuǎn)換背后潛在的重要的新機制，他們認為人體內(nèi)也有著更多的器官存在著性別差異。

進一步的研究需要將果蠅中的研究成果轉(zhuǎn)化為人類的研究。如果干細胞持有這種內(nèi)在的具有兩性發(fā)育的潛能，這表明了大多數(shù)器官或者組織都會有性別的“標記”，即存在性別差異，因此未來的治療可能要針對性別給出不同的解決方案。

石墨烯電極有助修復感知功能

英國劍橋大學的一項研究成果顯示，研究人員成功將石墨烯電極植入小鼠腦部，并直接與神經(jīng)元連接，這項技術(shù)未來可用于修復截肢、癱瘓甚至帕金森氏癥患者的感知功能，協(xié)助他們更好地康復。

石墨烯是從石墨材料中剝離出來、由碳原子組成的二維晶體，厚度與一層原子差不多。這種材料無論是彈性、強韌度以及拉伸性能方面都遠遠優(yōu)于鋼材等材料，被譽為“新材料之王”。

劍橋大學研究人員與意大利和西班牙的同行利用小鼠腦部細胞培養(yǎng)物進行相關(guān)實驗后發(fā)現(xiàn)，利用石墨烯材料制造的電極能安全地與腦部神經(jīng)元連接，且連接后這些神經(jīng)元可正常傳遞電波信號，不會產(chǎn)生不良反應(yīng)。

這些與神經(jīng)元直接連接的電極能把腦電波信號傳遞給外界，讓外界更清晰地了解腦部活動并修復感知功能。例如，機械臂如果能接收腦電波信號，就會按照截肢患者的想法去抓取物體；通過對這些腦電波信號的干預也會有助于帕金森氏癥患者更好地控制病情。但此前使用其他材料制作的電極效果并不理想，信號傳遞很不穩(wěn)定。

據(jù)介紹，石墨烯的導電性能非常優(yōu)異，測試中這一材料制作的電極實現(xiàn)了穩(wěn)定的腦電波信號傳遞，神經(jīng)元的一些特性也沒有因為與電極連接發(fā)生改變。

第7篇：基因工程疫苗范文

1葉綠體基因工程概述

1.1葉綠體簡介

葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復制,含有雙鏈環(huán)狀DNA。葉綠體DNA分子一般長120~160kb。葉綠體DNA有IRA和IRB2個反向重復序列(分別位于A鏈和B鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。

1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點

葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統(tǒng)的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數(shù)。葉綠體基因可實現(xiàn)外源基因的定點整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點,可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時間。

1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程

葉綠體轉(zhuǎn)化過程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物。

1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法

依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程,生物學家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株。二是農(nóng)桿菌T-DNA介導的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達。三是PEG處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的PEG濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。

2葉綠體基因工程的應(yīng)用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于Rubisco酶的豐富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量。很多科學家正試圖通過提高Rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價值的方法。

2.2合成有機物質(zhì)

由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點,已被越來越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機物質(zhì)的可靠場所。例如,有科學家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構(gòu)建了含phbB、phM、phbC和aadA基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。Northem點雜交、RT-PCR分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。

2.3生產(chǎn)疫苗

人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實現(xiàn)表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒VP3P1區(qū)和丙型肝炎病毒C區(qū)融合,并導入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白B(CTB)抗原CTB已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。Tregoning等將TetC基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mRNA的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優(yōu)化,分別表達了未經(jīng)改造的富含AT(72.3%AT)和人工合成的富含GC(52.5%AT)的基因,TetC-AT和TetC-GC的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗蟲性方面,Kota和Cosa分別于1999年、2001年將BTCryZAaZ基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4000多倍抗性的抗性蟲,后者報道BT表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼SOD、APx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受能力。

2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學上的應(yīng)用

葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學上的優(yōu)點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體DNA的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價值。然而,用葉綠體DNA研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來越多的葉綠體DNA被用作分子標記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。

2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景

當今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產(chǎn)生超級雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風險遠遠低于核轉(zhuǎn)化作物,因為大多數(shù)作物中的質(zhì)體DNA都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。

3葉綠體基因工程存在的問題

3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題

由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內(nèi)有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。

3.2植物的種類有待擴展

可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。

第8篇：基因工程疫苗范文

[中圖分類號]R-331 [文獻標識碼]B [文章編號]1673-7210（2008）05（c）-118-03

酶聯(lián)免疫吸咐試驗（ELISA）具有靈敏度高、特異性好的特點，廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查，如肝炎、HIV，也可應(yīng)用優(yōu)生優(yōu)育等。優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA實驗結(jié)果準確、可靠的必要條件。試驗中若不做好相關(guān)控制，易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象（空白、陰性、陽性對照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻明顯偏高）是各級臨床實驗室常遇到的問題。現(xiàn)將ELISA實驗操作中的影響因素總結(jié)如下：

1標本因素

以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA測定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標本凝固不全，在臨床試驗中，有時為了爭取時間而快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；采血試管洗滌不徹底、反復使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。

因此血清標本宜在新鮮時檢測，禁用嚴重溶血的標本。一般說來，在5 d內(nèi)測定的血清標本可放置于2～8℃，標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過1周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝冰存；最好使用一次性玻璃試管或真空采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷，能吸附酶標記物，不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性；血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。

2試劑因素

ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA反應(yīng)試劑盒。因此，有些廠家為了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應(yīng)結(jié)果。基因工程抗原較合成肽抗原有無抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了?；蚬こ炭乖c合成肽抗原的區(qū)別如下：

基因工程抗原是抗菌素原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點。①分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到數(shù)百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗菌素原，分子量更大。②穩(wěn)定性好。包被抗原的穩(wěn)定性決定試劑盒的有效期，早期以合成肽為包裝抗原的試劑盒有效期只有3～4個月，改作基因工程抗原后有效期大大延長了。③基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。④純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：分子量太?。灰话阒缓幸粋€抗原決定簇；純度高；穩(wěn)定性差。

國內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%，99.3%，78%，89%，存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用劣質(zhì)的試劑必然導致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準確的關(guān)鍵之一。

選擇試劑時應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差異小、操作方便、省時的優(yōu)良檢測試劑，國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質(zhì)量評估并定期評估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)； 要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年。最好選擇剛出廠的試劑使用；不同廠家的試劑不能混用。

不同方法學的檢測試劑會使乙肝兩對半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中，常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學發(fā)光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外，還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的區(qū)別。單抗對變異抗原或亞型乙型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對試劑的制備應(yīng)該考慮亞型及濃度的問題。

3操作技術(shù)

操作過程的控制：①嚴格按照試劑說明操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。②加樣后及時放入孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。③封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導致“盎”灞的出現(xiàn)。④用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干；還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象。⑤合理安排檢測量，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。⑥加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。⑦顯色劑盡量在臨用前配制，不使用過期顯色劑，肉眼可見淺藍的TM顯色劑不用。⑧加樣時保持顯色劑不外流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時要避免產(chǎn)生氣泡。⑨應(yīng)保證酶標板清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以得到更準確、更可靠的實驗結(jié)果。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性直接影響檢測結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

溫浴影響。在建立ELISA方法時做反應(yīng)動力學研究。實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。反應(yīng)板孔、反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。溫育的溫度和時間應(yīng)嚴格按規(guī)定控制，特別要注意邊緣位置。96孔酶標板結(jié)構(gòu)特別，易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度有嚴格要求，酶標板周邊孔與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELISA應(yīng)是靠洗滌來達到分離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固體相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌，不得馬虎隨意。

洗滌液多為含非離子性洗滌劑中的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，又含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)恢復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度為0.005%～0.02%，高于0.02%可使包被在固相上的抗原或抗體借吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導率小于1.5 μs/cm，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其溶解后配制。手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大。半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結(jié)果，血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞，造成未結(jié)合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”，造成假陽性或假陰性。所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應(yīng)用去離子水清洗幾遍。

保證洗板浸泡時間為40 s左右，孔內(nèi)液體被洗板機洗得越干凈越好。

4顯色和比色

TMB經(jīng)HRP作用后，約40 min顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2 h后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮納和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12～14 h）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變?yōu)槌赛S色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，使用前先預熱儀器15～30 min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結(jié)果一致性。

5 HOOK效應(yīng)

隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HOOK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減少HOOK反應(yīng)的發(fā)生。

6干擾物質(zhì)

有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)原性誘導的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃ 30 min滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦）在儲存過程中可能形成二聚體，會導致本底過深，影響檢測結(jié)果。

7藥物的影響

高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應(yīng)，導致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)。如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出，而且其所生的新生兒常出現(xiàn)HBsAg陰性、HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式，可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體與通過胎盤進入胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復合物，則新生兒HBsAg檢測呈陰性，用0.5 mol的鹽酸處理標本1 h可提高檢出率。

為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能夠把它檢出，如電化學發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應(yīng)做HBsAg檢測。

8 抗原自身因素

融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標本。

少數(shù)HBV感染后外周血中不含HBsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量為5 μg/ml～600 μg/ml。據(jù)文獻報道，到目前為止在獻血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg攜帶者最低含量為0.2 ng/ml，含量高者可達2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構(gòu)成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應(yīng)答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。最近，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變（氨基酸58～118）是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。

總之，優(yōu)質(zhì)的試劑、狀態(tài)良好的儀器、排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。

[參考文獻]

[1]李金明. 臨床酶免測定技術(shù)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2005.

第9篇：基因工程疫苗范文

乙肝疫苗是預防并最終控制乙型病毒性肝炎（乙肝）最有效的手段。我國以往乙肝基因工程疫苗的研究大部分單純以兒童或單純以成人研究為主，為了獲得乙肝基因工程疫苗的免疫效果和安全性，我們采用重組酵母乙肝疫苗對869例6~60歲的對象進行了免疫效果觀察，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象

采用多階段隨機抽樣的方法，把溫州市鹿城區(qū)人群分成城市和農(nóng)村兩個層進行抽樣，在城市163個居委會中隨機抽取6個居委會，在6個居委會的12 150人中抽取982人，在128個村中隨機抽取6個村，在6個村的18 620人中隨機抽取1 167人,年齡均在6~60歲之間，共計抽取居民2 149例，經(jīng)過篩選5項指標均為陰性且近期無感冒發(fā)熱，免疫前體溫正常，無接種乙肝疫苗史、肝病史及1年內(nèi)無輸血史者共1120人作為免疫對象。全程接種3針疫苗者共869人，失訪人群年齡、性別與在訪人群無差異。

1.2 疫苗

采用衛(wèi)生部北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)的重組（酵母）乙肝疫苗，劑量為每次1劑，19周歲及以上對象接種10 μg×3疫苗，19周歲以下對象接種5 μg×3疫苗，批號均為2004060204，均在效期內(nèi)使用。免疫程序為0、1、6月，接種途徑為上臂三角肌肌肉注射。

1.3 血清檢測指標及判定標準

免疫前篩選時用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測乙肝表面抗原（HBsAg）、保護性抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb），試劑為鄭州安圖綠科工程有限公司生產(chǎn)。免疫后1個月采血，采用時間分辨免疫熒光技術(shù)(TRFIA)法進行檢測，抗-HBs診斷試劑盒（IFM法）由上海新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑均在效期內(nèi)使用。檢測由專人負責，按照說明書操作。篩選時為定性檢測，免后用定量方法檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

資料采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)二次輸入，核對后采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 抗-HBs滴度水平

2.1.1 不同性別抗體滴度比較 按照Y=lg10(抗體滴度+0.001)進行轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后抗體滴度見表1。不同性別間差異有統(tǒng)計學意義，女性免疫后產(chǎn)生的抗體滴度高于男性。

表1 不同性別的抗體滴度比較

2.1.2 不同年齡組抗體滴度比較 隨著年齡增大，抗體滴度的幾何均數(shù)、中位數(shù)均有下降趨勢(χ2均＝0.943，n＝6，P＜0.05)(表2)。對不同年齡組抗體滴度幾何均數(shù)進行多元方差分析，不同年齡組之間一元方差分析中差異有統(tǒng)計學意義，二元、三元方差分析中則差異無統(tǒng)計學意義，年齡組與抗體滴度存在一元線性負相關(guān)，即年齡越低發(fā)生免疫應(yīng)答的抗體滴度越高（P=0.000）。

表2 不同年齡組的抗體滴度比較

對性別和年齡組與抗體滴度進行交互作用分析，結(jié)果表明，性別和年齡差異均有統(tǒng)計學意義（F=7.402 ＞F(1,857)0.01=6.680,F=9.363＞F(5,857)=3.045) 。由而性別和年齡與抗體滴度幾何均數(shù)不存在交互作用（F=1.578＜F(5,857)0.05=2.225)。

2.2 乙肝疫苗的安全性

接種乙肝疫苗后，只有2例對象出現(xiàn)局部輕微的紅腫,無發(fā)熱，48 h內(nèi)恢復正常，未出現(xiàn)嚴重的局部或全身不良反應(yīng)。

3 討論

3.1 抗體滴度高低的影響因素

本研究中接種對象發(fā)生免疫應(yīng)答后的抗體滴度女性的幾何均數(shù)、中位數(shù)均高于男性，這與以往報道相同[1~4]。不同年齡組間的抗體滴度幾何均數(shù)、中位數(shù)有隨著年齡的增高而減低的趨勢，且存在線性負相關(guān)，這點與時景璞等[5]報道的結(jié)果相一致，可能與年齡增高，人體對乙肝的免疫應(yīng)答敏感性減低有關(guān)，因此建議易感人群盡早接種乙肝疫苗。

3.2 性別、年齡與抗體滴度關(guān)系

不同性別中均存在抗體滴度隨著年齡升高而下降的趨勢，性別和年齡與抗體滴度的關(guān)系是獨立關(guān)系，兩者不存在交互作用，這點以前的文獻報道較少。兩者單個因素與抗體滴度關(guān)系與王昕等[2]報道的抗體陽轉(zhuǎn)率類似。

3．3乙肝疫苗的安全性

接種血源型乙肝疫苗可以發(fā)生過敏反應(yīng)[6]，但較少見。乙肝重組（酵母）基因工程疫苗接種后不良反應(yīng)一般較輕微[2]，重組（漢遜酵母）乙肝疫苗接種引起不良反應(yīng)較少見[7]，本研究未出現(xiàn)任何嚴重的不良反應(yīng)，說明國產(chǎn)重組（酵母）乙肝疫苗具有良好的安全性。

（課題組成員在現(xiàn)場采樣和實驗室檢測中做了很多工作，特此致謝）

4 參考文獻

［1］王昕,王英文,孫樹.重組酵母乙肝疫苗接種成人后抗體幾何平均滴度的研究［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計學,2003, 20（1）:60-61．

［2］王昕,孫樹,時景璞,等.成人接種重組酵母乙肝疫苗后免疫效果的評價［J］.中國醫(yī)科大學學報,2002,31（2）：121-122.

［3］張萬華，劉流.中小學生接種乙型肝炎疫苗免疫效果觀察［J］.右江民族醫(yī)學院學報，2006，4：653-654.

［4］張鳳梅，陳希平，楊傳志,等.不同人群接種重組（酵母）乙型肝炎免疫效果分析［J］.中國計劃免疫，2004，10（3）：150.

［5］時景璞，王昕，王桂花,等.成人接種重組酵母乙型肝炎疫苗免疫效果觀察［J］.中華預防醫(yī)學雜志，2002,36（6）：366-369.

［6］梁爭論,李河民,吳小音,等.中國乙型肝炎疫苗免疫效果和免疫機理的研究進展［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志,2002,16（1）:91-93.