肝纖維化精選(九篇)

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第1篇：肝纖維化范文

關(guān)鍵詞：肝纖維化；研究進展；肝組織

肝纖維化的發(fā)生是因為多種因素共同作用而引起肝損傷在組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，其以細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積作為臨床病例特征改變[1]。肝纖維化對肝組織的功能和結(jié)構(gòu)有一定的破壞性，能夠引發(fā)慢性肝臟損傷的疾病一般伴隨不同程度的纖維化，而最常見的疾病為病毒性肝炎，全世界慢性乙型肝炎患者人數(shù)為3.5億，我國發(fā)病率在近些年來也呈現(xiàn)上升趨勢[2]。處于進展期的肝纖維化患者可導(dǎo)致病變?yōu)楦斡不?，最終引發(fā)終末期肝病的臨床表現(xiàn)。及早發(fā)現(xiàn)肝纖維化對預(yù)防肝硬化有重要的意義，肝纖維化在臨床上無特殊表現(xiàn)，所以診斷方式依靠血清指標(biāo)檢查、影像學(xué)及組織病理學(xué)。

1.血清指標(biāo)檢查

使用血清指標(biāo)對肝纖維化發(fā)展及治療效果進行監(jiān)測，是近些年來臨床學(xué)者研究的重點，血清指標(biāo)與肝組織病理學(xué)纖維化程度之間關(guān)系非常密切[3]。目前全球的醫(yī)學(xué)界均未有理想的肝纖維化生化診斷標(biāo)準(zhǔn)。雖說如此，多項研究結(jié)果均有效證明，部分生化指標(biāo)可有效的將飯臟纖維生成和溶解過程充分反映出[4-5]。

1.1血清肝纖維標(biāo)志物

Ⅲ型前膠原氨基端肽和血清Ⅲ型前膠原：研究資料表明，以上兩種指標(biāo)可有效的反映出肝纖維化活動程度，其與肝臟的壞死、炎癥有一定的關(guān)聯(lián)，其水平會隨著肝纖維化程度的嚴(yán)重程度提高[6]。相關(guān)研究資料表明，以上兩種指標(biāo)反應(yīng)的是纖維化發(fā)生早期及其動態(tài)發(fā)展過程[7]。

Ⅳ型膠原：其是構(gòu)成基底膜的主要成分。肝纖維化現(xiàn)象出現(xiàn)后，對基底膜有一定程度的改變和破壞，Ⅳ型膠原增加速度較快，其反應(yīng)了膠原降解，纖維化早期明顯增加，同時伴隨的加重的趨勢，血清中含量增加則表明Ⅳ型膠原不僅對早期纖維化具有診斷意義，還可提示纖維化的進程。

Ⅰ型膠原：肝纖維化在早期、中期均以Ⅲ型膠原蛋白增生為主要依據(jù)，而肝纖維化在后期及肝硬化期間則主要以Ⅰ型膠原增生為主要的臨床依據(jù)。相關(guān)研究資料表明，肝癌及肝硬化合并的患者中Ⅰ型膠原增生較為明顯，慢遷肝、急肝、慢活肝等指標(biāo)均無增加現(xiàn)象，所以認(rèn)為Ⅰ型膠原對肝纖維化是否發(fā)展成為肝硬化的診斷有臨床意義，但其在肝纖維化早期、中期診斷方面無明顯影響[8]。

層粘蛋白：其是基底膜中獨特成分，肝纖維化發(fā)生的時候，層粘蛋白和Ⅳ型膠原Dise間隙附著，是的肝竇毛細(xì)血管化，阻礙肝細(xì)胞之間進行物質(zhì)交換，引發(fā)門脈高壓。有較多的臨床研究均認(rèn)為血清層粘蛋白和肝纖維化進程有聯(lián)系，和門脈高壓呈現(xiàn)正相關(guān)。但是血清層粘蛋白增高不只是在肝纖維化時發(fā)生，此種現(xiàn)象也在胰腺疾病或者惡性腫瘤患者體內(nèi)出現(xiàn)[9]。還有部分學(xué)者通過多元回歸相關(guān)分析顯示，層粘蛋白不能估計肝纖維化預(yù)后及其量。所以層粘蛋白在診斷中具有一定局限性[10]。

1.2細(xì)胞外基質(zhì)合成酶改變

單胺氧化酶：其是臨床早期用于診斷肝纖維化標(biāo)準(zhǔn)的項目。單胺氧化酶來源于線粒體，活性增高和體內(nèi)結(jié)締組織增生關(guān)系密切。

脯氨酰羥化酶：其是膠原合成關(guān)鍵酶，肝硬變患者體內(nèi)脯氨酰羥化酶含量增高速度快[11]。

1.3反應(yīng)細(xì)胞外機制降解指標(biāo)

基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制分子：經(jīng)過大量研究試驗表明，肝纖維化在早期時肝臟中有膠原酶，但是隨著肝纖維化的不斷發(fā)展，其活性明顯下降，甚至檢測不到其存在。

脯氨酸太酶：其是一種蛋白水解酶，廣泛的存在人體內(nèi)，和膠原蛋酶降解有密切關(guān)系，可有效反應(yīng)出膠原蛋白分解代謝的重要生活指標(biāo)。

2.影像學(xué)診斷

影像學(xué)檢查科從形態(tài)角度對肝臟病變的診斷提供臨床依據(jù)。在臨床MRI、CT、超聲波、纖維內(nèi)鏡、腹腔鏡、核素掃描均在臨床上廣泛的應(yīng)用，提高臨床診斷肝纖維化的水平。目前為止超聲是臨床上既經(jīng)濟、又方便無創(chuàng)，是較為常用的影像學(xué)檢查。超聲、MRI、CT檢查后所得的影像資料可互補，如以上可提供肝體積、肝表面積、門靜脈管徑、脾臟大小、肝實質(zhì)、脾靜脈管徑、血流參數(shù)等資料。相關(guān)研究資料表明，肝表面表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀、邊緣角變鈍、回聲不均勻、門靜脈增寬、脾變大等臨床表現(xiàn)均為肝纖維化診斷的標(biāo)準(zhǔn)[12]。進行多普勒超聲測定可根據(jù)門靜脈血流最大值和慢性肝病肝動脈評估肝纖維化程度，同時門靜脈側(cè)支循環(huán)、肝靜脈頻譜波形、淤血指數(shù)等指標(biāo)對肝硬化也有重要的臨床價值。相關(guān)學(xué)者使用瞬時彈性記錄儀器對慢性丙型肝炎肝纖維化進行評估，該儀器認(rèn)為彈性波傳播速度與肝纖維化之間有密切的關(guān)系[13]。在肝纖維化早期，肝臟的血流動力學(xué)和形態(tài)學(xué)改變不明顯，超聲下的生想學(xué)表現(xiàn)也不是非常明顯，所以超聲影像學(xué)檢查對早期肝纖維化診斷具有非常重要的臨床意義。

3.組織病理學(xué)診斷

在臨床上診斷肝纖維化和肝硬化方法中肝組織活檢仍然是最有效的方法。在2000年的《病毒性肝炎防治方案》指出，將慢性肝炎的驗證活動度分為5個等級（G0-G4），肝纖維化程度分為5期（S0-S4），其用在肝組織活檢診斷中[14]。但是此種分級方式不能滿足實際的研究工作中的需求，在研究工作中需要更詳細(xì)的分級系統(tǒng)。在最初的臨床研究中，應(yīng)用Knodell提出的肝組織學(xué)活動評分系統(tǒng)（HAI），之后逐漸趕緊為Ishak、METAVIR、Sciot、Scheuer診斷標(biāo)準(zhǔn)。我國現(xiàn)在主要應(yīng)用的是Scheuer。相關(guān)學(xué)者提出[15]，對纖維化半定量計分系統(tǒng)進行了改進，使用各種ECM組織化學(xué)免疫、常規(guī)HE染色、分子原位雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)等可從肝標(biāo)本中獲得更多的肝纖維化信息，使用半定量計分方法和病毒性肝炎的防治纖維分期有一定的關(guān)系，尤其說明其在診斷肝纖維化上具有非常顯著的優(yōu)點。

還有學(xué)者提出使用比色法、計算機圖像等新型的技術(shù)方法測定肝組織中膠原蛋白含量[16]，但是以上方式均對纖維組織增生的形態(tài)與位置忽略了考慮，此種方法不僅還處于探索階段，而且其不能夠完全充分的反應(yīng)出肝組織炎癥程度，在臨床上還需值得深入研究。目前為止，臨床上肝活檢技術(shù)還未普遍應(yīng)用，此種損傷性檢查存在的不足非常多，例如患者顧慮有一定的風(fēng)險、不易接受、有假陰性、隨訪、組織學(xué)取材不規(guī)范等等。所以對于肝纖維化病理學(xué)診斷較為常用的便是分級分期方式，評價肝纖維化治療效果較為常用的是半定量評分系統(tǒng)。

4.纖維化診斷進入基因水平

相關(guān)研究資料表明透明質(zhì)酸在臨床上診斷肝纖維化的最佳指標(biāo)[17]，但是部分學(xué)者使用ROC曲線進行比較研究后發(fā)現(xiàn)，血清PDGF-BB比其他指標(biāo)好，檢測外周血單個核細(xì)胞內(nèi)TMP-1的mRNA水平比血清蛋白水準(zhǔn)為最佳值[18-19]。

5.討論

臨床上聯(lián)合使用多種檢測手段，可為肝纖維化提供早期診斷的依據(jù)，同時還可對肝纖維化進程、肝硬化嚴(yán)重程度、預(yù)后、動態(tài)監(jiān)測、療效判定等進行判斷和分析，為臨床提供可靠的依據(jù)[20]。

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第2篇：肝纖維化范文

關(guān)鍵詞：肝纖維化；動物模型

中圖分類號：R322.4+7文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2008）09-0131-02

肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積的病理改變，也是許多肝病的中間環(huán)節(jié)。建立一個與人類肝纖維化的發(fā)生機制相似的肝纖維化的動物模型一直是科學(xué)研究的難點。選擇適當(dāng)?shù)母卫w維化動物模型是深入研究肝纖維化發(fā)病機制的重要基礎(chǔ)，也是篩選防治肝纖維化藥物的有效手段。近年來，肝纖維化動物模型的研究也取得了可喜的進展?，F(xiàn)將目前常用的造模方法及其原理、特點綜述如下。

1 中毒性肝損傷模型

1.1 四氯化碳法

四氯化碳（carbon tetochloride，CCL4）是最廣泛使用的化學(xué)肝毒物。CCL4法造模的途徑包括口服、腹腔注射和皮下注射，造模時間由途徑和劑量決定，一般為8周至4月不等［1］。如，40％CCL4油溶液，按2mL/kg體重的劑量，予Wistar大鼠腹腔注射，每周2次，共8周，可成功復(fù)制肝纖維化模型［2］。

CCL4是氯化烷烴類化合物，可選擇性損害肝、腎功能。CCL4進入體內(nèi)后可直接進入肝細(xì)胞，溶解肝細(xì)胞膜上的脂質(zhì)成分；也可以通過影響肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，啟動脂質(zhì)過氧化作用，致肝細(xì)胞損傷，變性，壞死，長期反復(fù)刺激可誘導(dǎo)肝纖維化形成。

CCL4致肝纖維化動物模型造模途徑多樣，簡便，費用低廉，病理特征穩(wěn)定可靠，復(fù)制時間短。CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)的某方面與人肝纖維化相似［3］。該模型的原始啟動機制顯然是毒性化學(xué)物質(zhì)對肝臟的損傷作用，比較適合藥物性肝炎方面的研究。但是能否準(zhǔn)確反映病原微生物感染人體后導(dǎo)致肝纖維化的機理，尚待進一步探討。其缺點在于CCL4肝毒性作用劇烈、動物死亡率高，不適合于周期較長的實驗研究。

1.2 二甲基亞硝胺法

1％二甲基亞硝胺（DMN）生理鹽水稀釋液，按10mL/kg體重的劑量腹腔注射，第1周連續(xù)3次，第2、3、4周各1次，6、7周各連續(xù)2次，8周可誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型［4］。

DMN是一種具肝毒性、細(xì)胞毒性和免疫毒性的藥物，長期低劑量可致肝癌，高劑量可導(dǎo)致壞死和肝纖維化。

DMN所致肝纖維化模型病變特點與人肝纖維化類似并具有肝纖維化形成率高、死亡率低、造模周期短、肝纖維化病變相對穩(wěn)定的特色［5］。與CCL4模型相比，該模型中肝細(xì)胞無脂肪變性，肝纖維化形成相對穩(wěn)定。DMN所致肝內(nèi)出血性病變與CCL4所致肝內(nèi)凝固病變不同，其肝損傷比較嚴(yán)重。

1.3 半乳糖胺法

雄性Wistar以500mg/kg腹腔注射半乳糖胺，隔日1次，共12周，可復(fù)制肝纖維化模型。半乳糖胺進入體內(nèi)后可造成尿嘧啶核苷酸的消耗，干擾核酸和蛋白質(zhì)的合成，生成自由基及脂質(zhì)過氧化，干擾膜結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死［6］。

此種模型的癥狀、生化、組織學(xué)表現(xiàn)與人體的接近，重復(fù)性好，對肝纖維化、肝癌、肝衰竭、肝性腦病等研究有重要價值。但此法因D-GalN價格較高而使其應(yīng)用受到限制。

1.4 鴨乙型肝炎病毒法

用鴨乙型肝炎病毒（DHBV）陽性血清反復(fù)攻擊復(fù)制鴨乙型肝炎纖維化模型，其特點是與肝炎病毒引起的肝纖維化較為接近。

2 免疫性肝損傷模型

將人血清白蛋白［7］或牛血清白蛋白［8］用生理鹽水稀釋，與等量的不完全福氏佐劑乳化，大鼠皮下多點注射，每間隔2周1次，共4次。經(jīng)測定血清中抗體陽性者，采用相應(yīng)異體血清白蛋白用生理鹽水稀釋后，尾靜脈注射攻擊，可復(fù)制免疫性肝纖維化動物模型。該法的原理是異源血清進入體內(nèi)，刺激大鼠產(chǎn)生抗體，繼而形成免疫復(fù)合物激活補體，長期的抗原刺激形成免疫復(fù)合物沉積肝匯管區(qū)和血管壁，引起Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)造成血管炎、血管周炎等局部炎癥反應(yīng)，進一步刺激膠原的增生而形成肝纖維化。目前造模常使用豬血清、牛血清、血吸蟲病血清等［9］。用豬血清法造模，3周時候可通過免疫組化顯示免疫復(fù)合物在血管壁周圍沉積，4周之后纖維組織明顯增多。停止注射后3個月，對先前形成的肝組織改變無影響。

該法的優(yōu)點是免疫法造模與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化和肝硬化在發(fā)病機制上更為接近，病變過程中肝細(xì)胞受損較輕，細(xì)胞外基質(zhì)以Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白沉積為主，肝組織形態(tài)清晰，有利于原位觀察和分析，適合肝臟免疫病理研究。缺點是其沒有病毒的持續(xù)復(fù)制及肝實質(zhì)的持續(xù)損傷，不能反應(yīng)人體慢性肝炎發(fā)病機制中病毒反復(fù)持續(xù)攻擊人體的特點。與人肝纖維化的病理生理過程尚有相當(dāng)大的差距。

3 血吸蟲性肝損傷模型

小鼠皮下多點注射血吸蟲尾蚴6～8周可復(fù)制血吸蟲性肝纖維化。形成的原理主要是門脈區(qū)寄生蟲卵的免疫反應(yīng)引發(fā)的炎癥［10］。此種模型病理變化比較特殊，主要用于血吸蟲病引起的肝纖維化的研究，不適于其他人類肝纖維化的研究。

4 膽源性肝纖維化模型

用膽總管結(jié)扎法，可在狗、大鼠、猴等動物中制作出實驗性膽汁性肝纖維化、肝硬化模型。該模型的原理與發(fā)生在人體的繼發(fā)性膽源性肝硬化的機制相吻合。通過結(jié)扎膽管或者注入硬化劑等方法人為地造成肝外膽道梗阻，引起梗阻部位以上膽管擴張。膽管阻塞的持續(xù)時間決定肝臟的病理改變，由于肝內(nèi)血管受到擴張膽管的壓迫及膽汁的外滲，肝細(xì)胞發(fā)生缺血和壞死，纖維向膽管延伸，包繞肝小葉，形成肝纖維化。

此法的優(yōu)點在于：①造模過程中炎癥反應(yīng)較輕；②肝纖維化形成快；③形成后短期不自發(fā)逆轉(zhuǎn)；④試驗指標(biāo)穩(wěn)定。

本模型適用于肝纖維化機理，篩選非創(chuàng)傷性肝纖維化血清學(xué)診斷指標(biāo)，尋找理想抗纖維化藥物的研究。

5 其它

5.1 高脂飲食法

給大鼠高脂－低蛋白飲食，制造肝硬化模型，該模型與人的酒精性肝病相似，較適用于人類酒精中毒性肝纖維化的研究。

5.2 復(fù)合法

由于單一因素的周期長、成功比例低，單一因素可能在加大劑量時不但不產(chǎn)生肝纖維化，而且增加動物的死亡率。因此部分學(xué)者采用復(fù)合因素制備模型。

利用復(fù)合因素制備肝纖維化，例如CCL4與乙醇聯(lián)合應(yīng)用造模；人白蛋白與CCL4聯(lián)合注射造模；DMN與小牛血清白蛋白綜合造模。但各種因素相互作用，機制更為復(fù)雜，給實驗的結(jié)果和分析帶來困難。

6 結(jié)語

作為一種傳統(tǒng)的研究手段，肝纖維化動物模型是深入研究肝纖維化發(fā)病機制的重要基礎(chǔ)，動物模型的制作在研究疾病的防治及病理生理方面起著至關(guān)重要的作用，同樣，進行藥物抗肝纖維化的研究必須建立合適的模型。

總的來說，理想的肝纖維化動物模型應(yīng)該符合如下條件：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似；②病變有一定發(fā)展過程；③形成率高，死亡率低，重復(fù)性好；④造模方法簡便易行；⑤動物易獲得，經(jīng)濟實用。目前，很多試驗者可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康膩磉x擇動物模型。

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第3篇：肝纖維化范文

關(guān)鍵詞：肝纖維化；肝炎；補陽還五湯

目前認(rèn)為肝纖維化是各種慢性肝病后肝硬化發(fā)展過程中不可避免的組織病理學(xué)改變，而抗肝纖維化治療也一直是肝硬化治療的難點之一。本研究擬觀察補陽還五湯對上述肝纖維化指標(biāo)水平的影響，探討補陽還五湯治療肝纖維化的效應(yīng)和機理，從而為進一步闡明該方治療肝硬化提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 觀察2010年6月～2014年6月成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院感染科門診和住院的慢性病毒性肝炎患者154例，診斷符合1995年5月全國傳染病寄生蟲病學(xué)術(shù)會議討論修訂的病毒性肝炎及肝纖維化修訂標(biāo)準(zhǔn)[1]。154例患者隨機分為兩組：治療組78例，對照組76例。其中治療組男61例，女17例；年齡31～65歲，平均43歲。對照組男56例，女20例；年齡33～63歲，平均47歲。病程1～20年。兩組患者在年齡、性別、病程、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結(jié)果等方面比較，差異無顯著性意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1 治療方法 治療組予補陽還五湯（黃芪50g、當(dāng)歸10g、川芎6g、赤芍12g、桃仁10g、紅花6g、地龍6g）水煎，1劑/d，分3次口服，同時給予對照組的治療。對照組采用傳統(tǒng)的保肝、對癥支持治療。兩組患者均不用其它任何抗纖維化的藥物和免疫調(diào)節(jié)劑。兩組均以3個月為1個療程。

1.2.2 觀察指標(biāo)及方法

1.2.2.1 臨床癥狀 觀察患者主要的臨床癥狀及體征，如乏力、納差、腹脹、脅痛的緩解情況。

1.2.2.2 血清學(xué)檢驗：兩組患者治療前后的血清學(xué)指標(biāo)統(tǒng)一檢測，包括HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、乙肝五項HBV-DNA、HCV抗體、膽紅素、白蛋白、球蛋白、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）等。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料采用t檢驗，計量資料采用x2檢驗。

2結(jié)果

2.1 臨床癥狀及體征 見表1，兩組治療后主要的臨床癥狀及體征較治療前顯著緩解（P

2.2 肝功能變化 治療組78例患者中，血清ALT升高48例，治療后復(fù)常36例（75.0%）。對照組76例患者，血清ALT升高45例，治療后復(fù)常19例（42.2%）。兩組比較，差異有顯著性（P

2.3 兩組治療前后血清肝纖維化指標(biāo)測定結(jié)果比較 見表2，治療組治療后血清肝纖維化指標(biāo)HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN均較治療前顯著降低（P

3討論

慢性乙型病毒性肝炎在我國屬于常見病、多發(fā)病，部分患者最終可發(fā)展至肝硬化、肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害著廣大患者的身心健康。肝纖維化是慢性肝病共有的病理特征，是各種病因?qū)е赂斡不牟±砘A(chǔ)，肝纖維化是可逆性病變，肝硬化則不可逆[2]。因此阻斷及逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療肝硬化乃至減少肝癌發(fā)生的關(guān)鍵，而西藥對肝纖維化的治療尚缺乏理想的藥物和方法，目前認(rèn)為有一定療效的藥物如干擾素等，副作用大，費用高，療效尚不確切。為此在本研究中以臨床的常規(guī)治療作為對照來觀察補陽還五湯抗肝纖維化的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝硬化屬中醫(yī)""痞塊""臌脹"之范疇，從中醫(yī)辨證來看，早期肝硬化往往是以氣虛血瘀或其他證型兼有血瘀為常見。因此，我們采用益氣活血之法，選用經(jīng)典方補陽還五湯治療。方中黃芪健脾益氣，當(dāng)歸補血活血，川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍活血化瘀。而現(xiàn)代研究表明，黃芪中的黃芪皂甙具有抗肝損傷的作用，能減輕肝中毒引起的病變，且黃芪尚有防治肝纖維化的作用，可抑制體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，并可激活膠原蛋白的降解，當(dāng)歸的有效成分阿魏酸鈉的作用，是使TXA2/PGI2水平趨于正常，減輕了TXA2對肝臟的損傷作用，增強了PGI2的保護作用。赤芍的有效成分芍藥甙能改善肝臟微循環(huán)，降低門脈壓力，促進肝纖維化組織學(xué)改變。諸藥合用，共奏益氣活血之功效。本研究表明，補陽還五湯具有改善患者臨床癥狀和恢復(fù)肝功能效果，且對肝纖維化指標(biāo)HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN的異常有明顯的改善作用，從而阻止肝纖維化向肝硬化發(fā)展。

參考文獻：

第4篇：肝纖維化范文

關(guān)鍵詞 肝纖維化 復(fù)肝抗纖方 拆方 實驗研究

肝纖維化是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組織學(xué)變化，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。研究認(rèn)為，肝臟慢性損傷過程中細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積所形成的肝纖維化是可逆的，而肝硬化則是難以逆轉(zhuǎn)的。因此，減緩或阻止肝纖維化進程顯得十分重要。

復(fù)肝抗纖方是盧良威教授抗肝纖維化治療的經(jīng)驗方，其療效已被多年的臨床實踐和前期的動物實驗所證實

1 材料與方法

1．1 動物：清潔級SD大鼠70只，雄性，體重200±20g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1．2 藥物：復(fù)肝抗纖方由穿山甲、山慈菇、茯苓、水紅花子等組成，活血化瘀組由穿山甲等組成，活血利水組由茯苓等組成，化痰散結(jié)組由山慈菇等組成，藥物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供，并由該部門制劑室制成水煎濃縮劑，每毫升含生藥量1g；復(fù)方鱉甲軟肝片由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)（批號：Z19991011）。

1．3 試劑：四氯化碳，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司（批號：040917）；橄欖油，化學(xué)純，中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司（批號：F20030725）；VG染色試劑盒，福州邁新生物公司（批號：210208001）。

1．4 動物肝纖維化模型制備：在70只大鼠中隨機抽取60只用于制備肝纖維化模型，10只作為正常對照組。將四氯化碳與橄欖油按4∶6比例配成40％油劑，按0．3ml/100g劑量皮下注射，每周2次。

1．5 分組及藥物干預(yù)：將60只大鼠隨機分成6組：模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、復(fù)肝抗纖方全方組（以下簡稱全方組）、活血化瘀組、活血利水組、化痰散結(jié)組，每組10只。在造模的同時，給予藥物干預(yù)，給藥劑量按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法

1．6 肝功能及血清透明質(zhì)酸測定：全部大鼠摘眼球取血，分離血清，用自動化學(xué)分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），用放射免疫法測定血清透明質(zhì)酸（HA），試劑盒購自上海生物制品研究所。

1．7 肝組織病理學(xué)檢測：肝組織經(jīng)中性磷酸緩沖液固定，石蠟包埋，蘇木素－伊紅（HE）染色和VG染色，判定炎癥和纖維化程度并記分

1．8 統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。統(tǒng)計學(xué)采用t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié)果

2．1 藥物對血清肝功能的影響：與模型組比較，各用藥組ALT和AST的含量有不同程度的下降，其中活血化瘀組ALT含量下降顯著，化痰散結(jié)組AST含量下降顯著，全方組及活血化瘀組ALT、AST均有顯著下降。見表1。

2．2 藥物對血清透明質(zhì)酸的影響：與模型組比較，全方組及各拆方組血清HA水平均顯著下降，與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較無顯著差異。見表2。

2．3 藥物對肝臟組織病理變化的影響：各實驗組炎癥活動度計分、纖維化程度計分比較顯示：全方組及各拆方組大鼠肝纖維化程度有明顯改善，與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較無顯著差異。見表3。

3 討論

肝纖維化的形成機制復(fù)雜，是由多種因素參與、共同影響的結(jié)果。如肝內(nèi)多種細(xì)胞的激活、肝星狀細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積等都是肝纖維化形成的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在肝纖維化過程中起重要作用，肝臟發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞損傷，這種改變作為始動因素通過一系列復(fù)雜變化最終促使肝纖維化形成。

肝纖維化類似于中醫(yī)的“積”、“瘕”?！鹅`樞?百病始生》篇云：“溫氣不行，凝血蘊里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣?！敝T如“濕熱疫毒”、“蠱毒”及飲食不節(jié)等致病因素，致肝郁不暢，陽氣不能暢行，進而導(dǎo)致血凝在里不能消散，津液的輸注發(fā)生澀滯，終致痰濕、瘀血沉積，肝絡(luò)瘀阻成。因此，盧良威教授認(rèn)為“凝血蘊里、津液澀滲”是肝纖維化的病機

“藥有個性之特長，方有合群之妙用”。本實驗將全方按藥物不同作用拆成活血利水組、化痰散結(jié)組和活血化瘀組，結(jié)果顯示活血利水組有降低ALT的作用，化痰散結(jié)組有降低AST的作用，全方組及活血化瘀組對AST、ALT均有降低作用。血清ALT是肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，在肝損早期即可出現(xiàn)。AST大部分存在于線粒體中，肝損輕微或肝病早期，肝細(xì)胞損傷但線粒體仍保持完整。只有當(dāng)病變持續(xù)嚴(yán)重時，線粒體同時遭到嚴(yán)重破壞，AST從線粒體的胞漿中釋出?；钛M和化痰散結(jié)組分別對ALT、AST有明顯的降低作用，這是否與ALT升高時津血澀滯表現(xiàn)明顯、AST升高時痰凝瘀滯表現(xiàn)明顯有關(guān)，值得進一步研究。全方組對改善肝功能、肝纖維化程度均有明顯作用，顯示中藥復(fù)方發(fā)揮組間配伍的優(yōu)勢。

4 參考文獻

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［3］袁盛榕.藥理學(xué)實習(xí)教程［M］.北京，世界圖書出版公司，1994：13.

［4］王泰齡，劉霞，周元平，等.慢性肝炎炎癥活動度及纖維化程度記分方案［J］.中華肝臟病雜志，1998，6（4）：195-197.

第5篇：肝纖維化范文

[關(guān)鍵詞] 肝纖維化;透明質(zhì)酸;層黏蛋白;Ⅲ型前膠原;Ⅳ型膠原

[中圖分類號] R575.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1674-4721(2009)07(b)-050-02

肝纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時,肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生所致的病理過程是各種慢性肝病的共同病理過程,也是發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路。提高肝纖維化的診斷并及時干預(yù),有利于肝病的預(yù)后。本文對我院門診及住院的143例肝炎、肝硬化患者的HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C四項肝纖維化指標(biāo)進行分析,探討它們對肝纖維化診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2008年11月～2009年4月的門診及住院患者共143例。其中男性100例,女性43例,年齡16～78歲,平均43歲,按2000年全國傳染病與寄生蟲病學(xué)術(shù)會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分型[1],慢性肝炎輕度36例,中度55例,重度30例,肝硬化22例,對照組30例。

1.2 試劑與方法

空腹抽取血5 ml,及時分離血清,-20 ℃保存,1周內(nèi)測定血清的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C,試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供,使用西安二六二廠生產(chǎn)的XH-6020,γ-放射免疫計數(shù)器分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

各項指標(biāo)用 (x±s)表示,用t檢驗,P

2 結(jié)果

各組肝病HA、PCⅢ較正常對照組均升高,在輕、中度肝病患者LN、Ⅳ-C升高不明顯,在重度及肝硬化患者HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C四項指標(biāo)均明顯升高(P

3 討論

肝纖維化是肝臟彌漫性、過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成多(或)降解不足的直接結(jié)果[2],是肝硬化的前期病理階段,是肝臟受到慢性損傷時,ECM可逆性沉積的創(chuàng)傷愈合過程。盡早發(fā)現(xiàn)肝纖維化并及時抗纖維化治療能減少肝硬化的發(fā)生,改善肝病患者的預(yù)后。HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C均為細(xì)胞外基質(zhì),在肝纖維化的發(fā)展過程中,參與膠原纖維的成分(Ⅳ-C、PCⅢ)、蛋白多糖(HA)及參與基質(zhì)組成的非膠原結(jié)構(gòu)的黏連糖蛋白(LN)均明顯增加。研究表明,HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平變化與肝纖維化的活動水平、程度及肝損傷程度有密切關(guān)系,作為肝纖維化的非創(chuàng)傷性診斷有重要意義[3-4]。

作為肝纖維化的血清學(xué)指標(biāo),其機制各不相同。HA是人體基質(zhì)的重要成分之一,主要是肝內(nèi)代謝,參與基質(zhì)中蛋白多糖的形成,還影響細(xì)胞遷移、分化、細(xì)胞間相互作用及淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能。四種指標(biāo)中以HA最敏感,它是一種蛋白多糖,是維持間質(zhì)膠體性的重要成分,主要由肝間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成,攝取和降解在內(nèi)皮細(xì)胞中完成。肝臟受損時,肝臟中的蛋白多糖成分增多,反應(yīng)了肝竇內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞增生致HA合成增多,肝血流受阻使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞受損致HA攝取和降解減少[5],使血中的HA增加。以上表明血清中的HA水平能反應(yīng)肝臟纖維化的活動性及肝損傷及程度。PCⅢ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,能反應(yīng)肝臟Ⅲ型膠原的合成代謝,在纖維化早期可增高[6],因此,PCⅢ的增高間接反映了肝臟Ⅲ型膠原的合成加速。文獻中報道在肝硬化晚期因纖維合成與增生不如初期活躍,PCⅢ可較前降低[7]。本文資料顯示,在各型肝病中HA及PCⅢ均增高,隨肝病程度加重增高更明顯,而PCⅢ在肝硬化期增高不如肝病重度期,說明在肝硬化時PCⅢ的診斷價值有所下降。Ⅳ-C是基膜的主要組成成分之一,正常肝血竇周圍缺乏基膜構(gòu)造,而在肝纖維化時Ⅳ-C顯著增加,與LN一起參與基膜的形成和發(fā)展。它能較好地反映肝炎向纖維化發(fā)展的過程和程度。LN在肝臟中與Ⅳ-C、硫酸己酰肝素等共同組成基底膜;在肝纖維化、肝硬化的發(fā)展過程中,LN合成增加并沉積于Disse間隙中,與Ⅳ-C結(jié)合形成“血竇”毛細(xì)血管化,影響組織與血液問的營養(yǎng)和代謝的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致肝功能障礙,其水平在竇周纖維化時即明顯升高,可作為肝纖維化的診斷指標(biāo),LN血清水平與肝纖維化程度及門脈-肝靜脈壓力梯度有關(guān)[8],這些指標(biāo)分別從不同角度反映肝纖維化程度的變化,因此聯(lián)合檢測可以提高肝纖維化診斷的準(zhǔn)確性及可靠性。

本文結(jié)果表明,隨著肝病程度的加重,HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C的增高越明顯,說明慢性肝炎患者隨著病程的進展,病情的加重,肝纖維化程度增加。而肝硬化尤其以HA增高為主,說明HA增高水平與肝病的嚴(yán)重程度成穩(wěn)定的正相關(guān),提示可以將HA作為觀察肝纖維化的常規(guī)指標(biāo)。目前肝穿刺病理組織學(xué)檢查是判斷肝臟炎癥、纖維化的金標(biāo)準(zhǔn),但由于其為有創(chuàng)的檢查,多數(shù)患者不接受多次穿刺而不利于動態(tài)觀察,且存在取材的部位、標(biāo)本多少的抽樣誤差。而影像學(xué)檢查對肝纖維化的診斷難以定量化,因此聯(lián)合檢測血清肝纖維化指標(biāo)對慢性肝病纖維化的診斷及觀察病情演變有重要的臨床意義,且安全、簡便易行。

[參考文獻]

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第6篇：肝纖維化范文

關(guān)鍵詞：肝纖維化；細(xì)胞因子；轉(zhuǎn)化生長因子；神經(jīng)生長因子；腫瘤壞死因子-α；血小板衍生生長因子

【中圖分類號】R575.2 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1672-3783(2012)06-0004-02

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原)過度沉積，是細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和細(xì)胞基質(zhì)降解不平衡的結(jié)果，是各種慢性肝病后產(chǎn)生的一種共同反應(yīng)。它不是一個獨立的疾病，多種慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化。肝纖維化是由多種因素引起的慢性肝損傷后的組織修復(fù)過程，包括肝內(nèi)纖維母細(xì)胞(fibroblasts)，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，肌成纖維細(xì)胞(myofibrobasts，MF)，間質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells)等的活化，增殖。目前認(rèn)為，肝纖維化的中心事件是由于HSC的激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，并伴有ECM 的降解不足，導(dǎo)致大量的ECM沉積于肝臟，最終導(dǎo)致肝纖維化[1]。肝纖維化是肝硬化發(fā)展形成的必經(jīng)階段，所以如何預(yù)防，阻止以及逆反肝纖維化，成為了當(dāng)今肝病研究的熱點。而使活化狀態(tài)的HSC減少則主要是通過細(xì)胞的凋亡途徑，這個途徑的機制非常復(fù)雜，受到多種因素的調(diào)控，細(xì)胞-細(xì)胞，因子-因子相互制約，構(gòu)成肝纖維化調(diào)節(jié)的一個龐大的，錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。在肝纖維化的形成和發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β），神經(jīng)生長因子（NGF），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子起著重要作用，并成為當(dāng)今研究的新熱點。

1 轉(zhuǎn)化生長因子-β與轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad通路

1.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β：轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是一族結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能相似的活性多肽，具有多種生物學(xué)作用，可作用于多種細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、基質(zhì)產(chǎn)生和凋亡。其中TGF-βl是關(guān)鍵的致纖維化因子。在生理條件下，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有利于組織的損傷修復(fù)，但在病理條件下，過量的TGF-β1將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生而發(fā)生纖維化[2]。研究證實，急性肝炎時，TGF-βl的產(chǎn)生呈一過性的，而在慢性肝病中，TGF-βl不斷產(chǎn)生。適量的TGF-βl有利于細(xì)胞的創(chuàng)傷愈合，但過多的TGF-βl則導(dǎo)致纖維化。TGF-βl在纖維化的起始和持續(xù)發(fā)展所起到的關(guān)鍵作用主要表現(xiàn)在：①刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，造成ECM的過度沉積；②誘導(dǎo)基質(zhì)基因的表達，包括膠原、蛋白多糖和結(jié)構(gòu)性糖蛋白；③抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[3]。

1.2 轉(zhuǎn)化生長因子-β-Smad通路：TGF-β-Smad是肝纖維化時主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4],Smad分子為與線蟲Sma和果蠅Mad蛋白同源的蛋白家族，可將來自TGF-β的信號有胞膜受體傳導(dǎo)入胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮TGF-β的生物效應(yīng)[5]。應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的體外模型試驗來研究TGF-β1-Smad信號途徑在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞表型分化，及與終端分化相關(guān)的功能中的作用，結(jié)果顯示：TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞表型及功能的轉(zhuǎn)變是通過Smad的差異調(diào)節(jié)實現(xiàn)的[6]。另有研究[7]發(fā)現(xiàn)甘草酸能干預(yù)TGF2β-Smad信號通路，抑制Smad 2，3的表達并促進Smad7表達，從而發(fā)揮抗纖維化作用。Inagaki[7]等在動物模型中通過膠原生成細(xì)胞表達TGF2β-Smad選擇性拮抗劑來抑制肝纖維化，取得很好的效果且對其他臟器損害較小。

2 神經(jīng)生長因子

神經(jīng)生長因子（NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。陳新等人用實驗證實[8]將最適濃度的NGF100ng/mL與HSC共同培養(yǎng)24、48和72h，NGF一直與HSC增殖呈時間依賴性；將最適濃度的NGF與HSC共同培養(yǎng)24h，TUNEL法以及流式細(xì)胞術(shù)顯示NGF抑制HSC增殖是誘導(dǎo)其凋亡。其誘導(dǎo)凋亡的可能機制是受損肝細(xì)胞表達的NGF與活化HSC表達的P75結(jié)合在HSC膜上．促進P75誘導(dǎo)HSC的活性，促進了HSC的凋亡。在體外培養(yǎng)的HSC中[9]，隨著HSC活化程度的增加，NGF低親和力受體P57的表達也增多。活化后的HSC，給予NGF則會抑制HSC的增殖并誘導(dǎo)它的凋亡，并且肝細(xì)胞在肝損傷時表達NGF，在表達量達到高峰時HSC的凋亡量也達到最高。

3 腫瘤壞死因子-α

TNF-α是在細(xì)菌病毒感染，免疫復(fù)合物，化學(xué)藥物等因素刺激下由枯氏細(xì)胞釋放的。TNF-α對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，不但使HSC轉(zhuǎn)化為纖維母細(xì)胞，使其合成膠原和蛋白脂多糖的量分別增加3倍和2.6倍；同時，TNF-α還能抵消轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)抑制大鼠HSC增殖的作用，且促進其合成纖維蛋白和蛋白多糖[10]。臨床研究表明，TNF-α在肝硬化患者血清水平升高，與肝硬化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。在肝損傷和炎癥反應(yīng)中，TNF-α即可促進炎癥反應(yīng)，又可促進間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化和ECM 的合成，體內(nèi)大量TNF-α釋放可能參與肝臟的損傷修復(fù)循環(huán)，最終引起肝臟大量ECM 的合成與沉積，從而導(dǎo)致肝纖維化或肝硬化。所以，在預(yù)防和治療肝纖維化的過程中，應(yīng)格外注重TNF-α對肝纖維化的促進作用，增強對TNF-α的抑制。

4 結(jié)締組織生長因子

CTGF是由轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種致纖維化蛋白，具有多種生物學(xué)活性。肝纖維化的病理過程受著細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，結(jié)締組織生長因子作為TGF-β的下游反應(yīng)元件，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，不同類型的肝纖維化模型中均存在結(jié)締組織生長因子的高表達，且與病理上纖維化的程度相平行。研究表明，CTGF主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生，分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成，其異常高表達在器官纖維化等病理過程的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用[12]。隨著HSC活化及增值調(diào)控研究的深入，CTGF在細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化領(lǐng)域的研究引起關(guān)注。CTGF廣泛分布于人體各種組織，器官和體液中，具有促進細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞外基質(zhì)合成，趨化，促進細(xì)胞增生，分化，調(diào)節(jié)血管生成等作用，是一個重要的致纖維化因子。在實驗性大鼠及人肝纖維化肝組織中也發(fā)現(xiàn)CTGFmRNA表達水平明顯高于正常對照組，說明CTGF在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用[13]。目前認(rèn)為肝臟的慢性損傷使得竇周星狀細(xì)胞激活增殖，并伴隨著肌成纖維細(xì)胞分裂。而這個細(xì)胞系統(tǒng)已被認(rèn)為是竇細(xì)胞外基質(zhì)成分的主要來源。用免疫組化驗檢測細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)現(xiàn)一旦環(huán)境中有CTGF分泌，CTGF就會與肝臟細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生連接，在基質(zhì)周圍積聚。CTGF具有的TSP1區(qū)域與可溶性的機制分子的結(jié)合有關(guān)，尤其是硫化聚糖[14]。由此可推測，CTGF可以通過與一個在星狀細(xì)胞膜上表達的受體結(jié)合從而充當(dāng)自分泌刺激因子來增加細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達。

5 血小板衍生生長因子

血小板衍生生長因子(PDGF)由庫普弗細(xì)胞（KC）產(chǎn)生，它有三種形式的二聚體，PDGF受體由α與β兩個亞單位組成，PDGF與受體結(jié)合后，受體的酪氨酸殘基自動磷酸化，通過三磷酸肌醇激酶（ITPKC），信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白（STATs），鈣通道等影響使HSC活化與增殖。PDGF可促使FSC增殖并由“靜止”向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)化而成為肝成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。但據(jù)報道[15]，F(xiàn)SC必須經(jīng)KC分泌的一種因子而表達出PDGF受體后，才能對PDGF產(chǎn)生反應(yīng)。而且，它能促進多種細(xì)胞的有絲分裂，體內(nèi)多種正常細(xì)胞和病理細(xì)胞均可產(chǎn)生PDGF。PDGF能明顯增加肝內(nèi)儲脂細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞生長，從而促進儲脂細(xì)胞分泌膠原層粘連蛋白，蛋白多糖等[16]。

6 白細(xì)胞介素

可誘導(dǎo)HSC凋亡的白介素主要有促炎細(xì)胞因子IL-1，IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10三種[17]。這些細(xì)胞因子是由肝細(xì)胞（HC），F(xiàn)SC和KC分泌。IL-1可通過誘導(dǎo)FSC數(shù)目而積累更多的膠原，既能刺激膠原合成，又能刺激膠原酶合成，具有雙重作用。IL-6是一種單鏈糖蛋白，又稱HC刺激因子(HSF)，可由T細(xì)胞，B細(xì)胞纖維母細(xì)胞，肝細(xì)胞等產(chǎn)生[18]。IL-6可刺激HC、FSC和KC分泌多種細(xì)胞因子，形成強大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)作用。IL-10由CD4+T細(xì)胞和某些CD8+ T細(xì)胞分泌，人活化HSC、Kupper細(xì)胞、B細(xì)胞、活化單核細(xì)胞也可以產(chǎn)生IL-10，具有抑制巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能；抑制單核巨噬細(xì)胞依賴的抗原特異小鼠Thl和人類Th0、Th1、Th2類細(xì)胞的增殖；抑制Kupper細(xì)胞活化；降低TNF-α及NF-κb的產(chǎn)生，減輕肝損傷；抑制膠原合成，刺激膠原酶的產(chǎn)生。用IL-10降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT )水平，減輕肝組織炎癥反應(yīng)，減緩肝纖維化進程[19]。

7 天然抑制物金屬蛋白酶組織抑制劑

目前已闡明細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡，特別是后期降解減少是肝纖維化發(fā)生的主要機制。肝臟ECM的代謝主要由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制因子(TIMP)共同調(diào)節(jié)。MMPs促進ECM降解，而TIMPs通過特異性結(jié)合活化型的MMPs導(dǎo)致后者失活而阻止ECM降解，從而形成或促進肝纖維化。此外， TIMPs還通過抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中具核心作用的肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡而促進肝纖維化的持續(xù)發(fā)展[20]。有報道從TIMPs與診斷肝纖維化的三種主要方法和四項檢測指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，血清中TIMP-1與纖維化分期(s)較之其他四項血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性最強，從側(cè)面證明了TIMP-1與肝纖維化的密切聯(lián)系，可將其與先前的四項診斷指標(biāo)合用，聯(lián)合檢測以提高診斷靈敏度和特異度[21]。叢敏等[22]以腺相關(guān)病毒(AAV)為載體，含有針對大鼠TIMP-1具有較強抑制作用的小分子干擾RNA感染大鼠星狀細(xì)胞系HSC-T6后，結(jié)果顯示TIMP-1表達對其有顯著的抑制作用。

8 結(jié)語

影響肝纖維化的機制錯綜復(fù)雜，活化的HSC是肝纖維化形成及發(fā)展的核心，而有研究表明，纖維化形成過程中活性HSC不僅來源于靜息狀態(tài)的HSC，現(xiàn)肝門區(qū)成纖維細(xì)胞、循環(huán)纖維細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、上皮間充質(zhì)細(xì)胞均有轉(zhuǎn)化為HSC的可能,因此將來針對這些靶細(xì)胞的治療可能會是抗纖維化治療的新趨勢[23]。

在抗肝纖維化治療方面，盡管人們圍繞種種抗纖維化的細(xì)胞因子，蛋白等的作用機制提出了種種設(shè)想并作出了很多有意義的嘗試，但距離得出有指導(dǎo)意義的確切結(jié)論仍相去甚遠(yuǎn)?；谶@種機理所制得的各種治療藥物對各種因素的改善在整個疾病中究竟有怎樣的地位，能不能最終影響疾病預(yù)后，在肝纖維化不同時期HSC的活化有何不同，決定肝纖維化不可逆的因素究竟是什么等諸多問題，尚待從基礎(chǔ)到臨床的大量反復(fù)試驗中尋找答案。

另外，值得注意的是，肝纖維化過程中各種信號通路相互聯(lián)系，與細(xì)胞因子等外部因素一起形成錯綜復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)體系，所以在研究過程中要想以單一方式來逆轉(zhuǎn)或者治療肝纖維化具有一定的難度，需綜合考慮各種因素，各種信號通路，在研究肝纖維化的機理方面取得更多深入的突破。

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第7篇：肝纖維化范文

【關(guān)鍵詞】 肝硬化;肝纖維化; 扶正化瘀膠囊

肝纖維化是肝臟受損傷后向肝硬化轉(zhuǎn)變的重要途徑和標(biāo)志, 如何阻止或延緩肝組織受損后纖維化的改變, 是肝病治療尤其是防治肝硬化的關(guān)鍵措施。肝硬化以氣血瘀滯為主要矛盾,與微循環(huán)障礙所致的病理改變相符。對肝纖維化的中醫(yī)治療多以活血化瘀為主,采用扶正化瘀膠囊治療肝硬化患者43例, 效果較為滿意, 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)及一般情況 80例患者均為2009年9 月至2009 年12月住院以及門診患者, 診斷符合2000年9月西安第十次全國病毒性肝炎及肝炎學(xué)術(shù)會議制定的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。男48例,女32例;年齡29~57歲,平均(40.3±7.3）歲。全部為肝炎后肝硬化,病程1~26.0年,平均(18.3±5.9）年。根據(jù)肝功能child pugh分級, A級40例,B級30例。按入選順序以隨機數(shù)字表法將患者隨機分為治療組43例,對照組37例。兩組患者在性別、年齡、病程、肝功受損程度、合并病及腹水方面經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無明顯差異,具有可比性。兩組患者均排除了心、肺、腦、腎等重要臟器疾病,無出血傾向，無妊娠及哺乳期婦女。治療前均未用活血藥。

1.2 治療方法 兩組均采用肝炎肝硬化的常規(guī)治療方法, 如保肝、降酶、降門脈壓、消除腹水、防治感染、維持水電平衡及對癥處理。在此基礎(chǔ)上,治療組加用扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥有限責(zé)任公司)3次/d，3粒/次，療程24周。

1.3 檢測指標(biāo)及方法 所有患者于治療前、治療6個月、常規(guī)檢測下列指標(biāo):①肝纖維化指標(biāo)用放射免疫法檢測：透明質(zhì)酸(HA)、III 型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IVC)、層粘連蛋白(LN)見表1;肝、膽、脾檢查使用美國Diasonics2Syner2 gy2C 型彩色多普勒超聲儀見表2，專人操作, 觀察與上述檢查同步進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示, 采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 治療前后患者血清肝纖維化指標(biāo)的改變情況，見表1。治療前兩組血清HA、LN、P-Ⅲ-P、Ⅳ-C含量均值無顯著差異。治療組治療6個月后肝纖維化指標(biāo)明顯下降, 兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.2 B超檢查情況比較 治療前兩組病例B超評分、肝門靜脈主干寬度、脾厚、脾靜脈寬度指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。治療組治療6個月后脾較前回縮,門靜脈內(nèi)徑(PV)、脾靜脈內(nèi)徑(SPV)明顯縮小,與對照組比較,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

2.4 藥物不良反應(yīng):兩組患者用藥前后均進行了血、尿常規(guī)及腎功能檢查, 未發(fā)現(xiàn)異常, 心肌酶譜檢查也無明顯變化, 80例患者均完成治療。

3 討論

肝纖維化是各種致病因素所引起等引起肝細(xì)胞變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤,激活肝星狀細(xì)胞（HSC,）導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增多與異常沉積，合成與降解失衡的結(jié)果化。肝纖維是諸多慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)病理過程［2］，其特征為大量ECM沉積于Diss間隙，病理特點為匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)大量的以I、III型膠原為主的纖維組織增生和沉積，纖維隔形成、肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死和結(jié)節(jié)狀再生［3］，纖維隔中所存在的血管直接將肝動脈及門靜脈的血流分流出肝臟，減少與肝實質(zhì)接觸膠原纖維沉著導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化，阻礙血流與肝細(xì)胞接觸肝動脈與門靜脈交通支開放，以及小葉中心纖維化阻礙血流進入肝靜脈，而加劇門脈高壓。臨床見有營養(yǎng)障礙、門脈高壓、脾亢、腹水等。慢性肝病除肝病本身血流障礙、靜脈回流受阻外,往往還涉及到全身的微循環(huán)障礙及血液流變性的異常,肝臟微循環(huán)障礙是慢性肝炎發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)［4］, 扶正化瘀膠囊方中桃仁活血祛瘀；冬蟲夏草補虛損、益精氣；丹參助桃仁活血化瘀；松花粉益氣潤燥。共奏活血化瘀、益精養(yǎng)肝解表三功效。臨床研究證實，該藥具有抗纖維化作用［5］：扶正化瘀膠囊還有抑制炎癥反應(yīng)，保護肝細(xì)胞抗肝損傷作用，能顯著促進膠原的重吸收及肝功能的復(fù)常，可抑制炎癥活動期肝纖維化顯著增高的肝組織膠原酶活性，促進肝內(nèi)膠原的降解［6］。本研究觀察到43例治療組血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯降低,門靜脈內(nèi)徑、脾靜脈內(nèi)徑縮小,脾臟回縮,明顯優(yōu)于對照組,值得臨床推廣應(yīng)用。扶正化瘀膠囊其多途徑、多層次、多靶點的綜合藥理作用，有抗肝纖維化、抗肝硬化作用，已顯示出獨特的優(yōu)勢，是治療肝纖維化有效的藥物。

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第8篇：肝纖維化范文

河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河北唐山 063000

[摘要] 目的 探討各種血清指標(biāo)與肝穿組織病理診斷纖維化程度的關(guān)系，分析與肝纖維化分期最為密切的血清學(xué)指標(biāo)以及FibroScan與肝纖維化分期之間的相關(guān)性，為肝硬化診斷開辟新思路。方法 本研究將對病毒性肝炎慢性乙型所導(dǎo)致的肝纖維化及肝硬化患者的各種血清學(xué)指標(biāo)進行檢測，并同時進行FibroScan檢查。結(jié)果 肝纖維化是慢性肝病進展的必經(jīng)過程，慢性肝炎階段如不積極治療病情進展出現(xiàn)肝炎，一部分患者甚至進展為原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，危及生命。結(jié)論 對慢性肝病肝纖維化程度的評估，是對病情預(yù)后以及早期治療和隨訪尤為重要的。積極尋求無痛、準(zhǔn)確率高的診斷方法越來越受到人們關(guān)注。

[

關(guān)鍵詞 ] 肝纖維化 ；肝硬化； 無創(chuàng)診斷FibroScan

[中圖分類號] R575.2

[文獻標(biāo)識碼] A

[文章編號] 1672-5654（2014）06（c）-0018-03

Research in the progress of non-invasive diagnosis of liver fibrosis

CHEN Cui ZHOU Hongxia

Basic Medical College of Hebei United University Department of anatomy, Hebei Tangshan 063000

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the pathological diagnosis of fibrosis in various indexes of serum and liver, analysis and the stage of liver fibrosis is the most close serological indexes and FibroScan with hepatic fibrosis staging relevance, open up new ideas for the diagnosis of liver cirrhosis. Methods This study will detect various serological indexes in patients with liver fibrosis and cirrhosis caused by chronic viral hepatitis B, and FibroScan examination at the same time. Results Hepatic fibrosis is a necessary process of chronic liver disease, chronic hepatitis stage, if not active treatment progression of hepatitis, some patients even progress to hepatocellular carcinoma, seriously affecting the quality of life, life threatening. Conclusion Assessment of hepatic fibrosis in chronic liver disease, is particularly important for prognosis and early treatment and follow-up. Actively seek painless, accuracy rate and high diagnosis method and more attention.

[Key words] Liver fibrosis; Cirrhosis; Noninvasive diagnosis of FibroScan

慢性乙型肝炎感染呈世界性流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約20億人曾感染過慢性乙型肝炎，每年約有100萬人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝硬化及其并發(fā)癥如消化道出血、肝衰竭、肝性腦病、原發(fā)性肝癌、肝腎綜合征、繼發(fā)感染、離子紊亂等。在我國是僅次于結(jié)核的最常見的慢性傳染病，已成為嚴(yán)重危害我國國民健康的重大公共衛(wèi)生問題。早期肝纖維化具有可逆性[1]，因此，預(yù)測及早期診斷纖維化對整個疾病的進程和療效尤為重要。目前肝穿刺病理組織檢查仍是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它有很多局限性，近年來肝纖維化無創(chuàng)診斷技術(shù)逐漸成熟并成為人們研究關(guān)注的熱點，肝纖維化無創(chuàng)診斷方法目前主要為影像學(xué)檢查及血清學(xué)檢查，廣泛應(yīng)用于臨床，以下對關(guān)于近年來相關(guān)研究進展做一綜述。

1血清學(xué)檢查

血清學(xué)檢查有下優(yōu)勢：經(jīng)濟、安全、痛苦小、可多次重復(fù)檢查、費用低患者易于接受，可實施動態(tài)監(jiān)測，與其他無創(chuàng)診斷技術(shù)結(jié)合可大大提高肝纖維化肝硬化診斷的準(zhǔn)確率。

1.1 直接血清學(xué)標(biāo)志物

肝纖維化形成明顯的標(biāo)志是肝星狀細(xì)胞(HSC)，它被激活后，可促進細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成分泌增加，因體內(nèi)代謝障礙，所致ECM降解減少，導(dǎo)致在肝臟的過度沉積，是機體對慢性肝損害的一種修復(fù)過程，最終形成肝硬化。ECM在上述降解過程中可產(chǎn)生很多分裂產(chǎn)物，這些產(chǎn)物就是我們臨床上常用的肝纖維化系列指標(biāo)包括：III型膠原(PCIII)、IV型膠原蛋白、層粘蛋白（LN）、細(xì)胞透明質(zhì)酸（HA）等。某研究曾提出，上述指標(biāo)與肝臟的纖維化程度有良好的相關(guān)性，可用于早期肝硬化的診斷。膠原蛋白在肝組織的增加應(yīng)該給我們敲響警鐘，是一個非常危險的信號，因為膠原蛋白含量與肝纖維化成正相關(guān)[2]。英國某學(xué)者進行相關(guān)研究后指出[3-4]臨床上85%患者適用于該項檢查，同時提出透明質(zhì)酸HA及凝血酶原指數(shù)為最佳檢測指標(biāo)。該指數(shù)可以評估肝纖維化的程度，但對于早期肝纖維化不敏感，特異性差，并受許多變化因素影響，如新陳代謝，排泄等均可影響其結(jié)果[5]。

1.2 間接血清學(xué)標(biāo)志物

對于肝臟病理生理過程，間接肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)雖然沒有直接參與，但隨著肝纖維化、肝硬化疾病進展，逐漸改變，如（轉(zhuǎn)氨酶水平、凝血、血小板計數(shù)、白蛋白、膽紅素、膽堿酯酶等）。一項研究表明血小板、凝血酶原時間對肝硬化程度預(yù)測有一定意義[6]。美國學(xué)者通過研究提出，谷草轉(zhuǎn)氨酶與血小板計數(shù)通過特殊計算可得出無創(chuàng)診斷指數(shù)。但是，因為不同研究中，所選擇的病例不同，診斷模型中所選擇的血清學(xué)指標(biāo)各有不同，也有研究中表明，肝臟血清學(xué)指標(biāo)中僅有白蛋白及球蛋白對肝纖維化診斷有幫助，其他指標(biāo)容易受肝細(xì)胞壞死及炎癥的影響，不能幫助診斷肝纖維化[7]。因此，單獨一項檢查精度不高，沒有特異性，往往結(jié)合幾個有價值的臨床診斷模型，以提高診斷的準(zhǔn)確性，常用的有以下兩個指標(biāo)APRI及FibroTest指數(shù)。APRI該模型應(yīng)用比較簡單，但期準(zhǔn)確性不高。FibroTest指數(shù)容易受到公式變量的影響，如肝臟炎癥、應(yīng)用抗病毒藥物等均可對其結(jié)果造成一定影響[8]。

總之血清學(xué)檢查應(yīng)用于臨床具有一定的優(yōu)勢,但其特異性靈敏度和準(zhǔn)確度仍然需要改進。

2影像學(xué)檢查

2.1 肝臟瞬時彈性檢測儀（FibroScan）

2.1.1 工作原理及測量方法 這是一個非植入性醫(yī)療設(shè)備，是一個一維瞬時彈性圖技術(shù)為基礎(chǔ)的儀器，儀器上配備一個探頭，跟蹤彈性剪切波獲取它的速度，根據(jù)傳播速度計算出肝臟硬度值。肝臟組織中硬度值越高的部分，彈性剪切波的速度更快，從而得知肝組織的彈性和彈性剪切波的速是有關(guān)的，測得結(jié)單位用千帕表示。以下是操作成功的正常肝臟及肝硬化瞬時彈性成像圖，見圖1、2。

2.1.2 FibroScan測量肝臟硬度的影響因素 一項實驗認(rèn)為人體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＞28是影響肝臟硬度值檢測的唯一因素。有學(xué)者[9-13]通過研究得出ALT異常、膽紅素、大血管、腹水、脂肪肝、肝占位性病變等均影響其檢測結(jié)果。一項研究提出[14]肝纖維化、肝脂肪變性、肝組織炎癥壞死為影響肝硬度值的前三位因素，肝纖維化對肝硬度的影響占絕對優(yōu)勢。因此盡管FibroScan目前已廣泛應(yīng)用于臨床，但其仍有很多影響因素，很多研究者已經(jīng)嘗試將FibroScan與其他無創(chuàng)性肝纖維化診斷方法相結(jié)合以提高診斷的準(zhǔn)確率。

2.2 超聲檢查

目前超聲檢查在臨床上仍作為肝纖維化肝硬化診斷的初步篩查方法。肝纖維化和肝硬化的超聲檢測指標(biāo)多，不同的學(xué)者有不一樣的關(guān)注點，目前臨床上以脾靜脈內(nèi)徑、脾長徑和肝表面結(jié)節(jié)的準(zhǔn)確率比較較高[15]。B超在中晚期肝硬化的診斷價值目前在臨床上是肯定的，但對于肝纖維化、早期肝硬化的診斷應(yīng)結(jié)合其他的非侵入性診斷方法綜合評估。

2.3 磁共振彈性成像（MRI）

相對超聲而言，該項檢查受檢查者影響較小，能更好更全面的顯示肝臟整體結(jié)構(gòu)變化及與周圍組織關(guān)系，但費用較高，臨床上不作為首選檢查手段。有研究指出[16-21]，正常對照組與慢性肝炎病人的核磁成像顯示，區(qū)別輕度和中重度纖維化肝硬化的特異性及靈敏度分別為86%和85%。

3結(jié)語

縱上所述無創(chuàng)肝纖維化診斷方法多樣，層出不窮，但到目前為止沒有一個單一指標(biāo)能快速、準(zhǔn)確、靈敏的反映肝纖維化程度,因此目前臨床使用各種技術(shù)手段聯(lián)合應(yīng)用、綜合評估肝纖維化程度,為肝纖維化的早期診斷提供準(zhǔn)確的依據(jù)。

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第9篇：肝纖維化范文

【摘要】  目的 篩選鱉甲抗肝纖維化的活性組分。方法 傳代培養(yǎng)的hsc-t6與鱉甲bj61～bj68共同培養(yǎng)72h后，采用mtt比色法測定各濃度組hsc-t6的增殖情況。結(jié)果 bj61～bj65和bj68對hsc-t6細(xì)胞無抑制作用，而bj66和bj67有較強的抑制作用。結(jié)論 bj66和bj67為鱉甲的活性組分。

【關(guān)鍵詞】  鱉甲;活性組分;mtt比色法

[abstract] objective to screen the active constituent from carapax trionycis. methods secondary culture hsc-t6 in vitro,which was co-cultrued with bj61-bj68 ,then mtt assay was applied to detect the impacts of trionyx sinensis at different concentrations on hsc-t6. results bj61 - bj65 and bj68 had no inhibitory effect on hsc - t6 cells, but bj66 and bj67 had a stronger inhibitory effect on hsc - t6 cells. conclusion bj66 and bj67 is the active constituent from carapax trionycis.

[key words] carapax trionycis ;active constituent;mtt

鱉甲為鱉科動物鱉 trionyx sinensis wiegmann 的背甲，具有滋陰潛陽、軟堅散結(jié)、退熱除蒸的功效[1]。鱉甲常用于治療慢性肝病、預(yù)防肝硬化[2～4], 是治療肝纖維化疾患的常用中藥，但鱉甲的活性成分鮮見報道。本實驗依據(jù)活性篩選的思路, 在高建榮等[5]確定分子量小于6000的多肽為鱉甲抗肝纖維化活性部位的基礎(chǔ)上，采用葡聚糖凝膠g-25、葡聚糖凝膠g-15進一步分離為8個組分，再用mtt比色法進一步篩選鱉甲抗肝纖維化的活性組分,為后續(xù)的篩選活性單體奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 大鼠肝星狀細(xì)胞系(hsc-t6)由浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病研究所提供。

1.1.2 試驗藥物及主要試劑 (1)試驗藥物：鱉甲(醋制品)由浙江衢化醫(yī)院提供，粉碎后過80目篩。(2)細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胰蛋白酶(trypsin)、非必需氨基酸(neaa)、 high-dmem培養(yǎng)基，gibco產(chǎn)品 ;胎牛血清，武漢三利生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;青霉素、鏈霉素，華北制藥股份公司產(chǎn)品;二氧化碳(co2)，武漢市明輝氣體科技有限公司。(3)細(xì)胞增殖用試劑：二甲基亞砜 (dmso)、噻唑藍(lán) (mtt)，武漢凌飛科技有限公司。(4) 葡聚糖凝膠g-25、葡聚糖凝膠g-15:北京慧得易公司。

1.1.3 儀器 co2培養(yǎng)箱，日本 sanyo公司產(chǎn)品;全自動酶標(biāo)儀，美國 bio-rad公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡，日本olympus公司產(chǎn)品;潔凈工作臺，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 鱉甲透析物干燥粉末的制備 精密稱取鱉甲粉末100g，加200ml雙蒸水超聲提取20min，抽濾，殘渣加水100ml超聲10min，抽濾，合并濾液，冷凍干燥得凍干粉。再用少量水將凍干粉溶解，裝于透析膜內(nèi)，用100ml水于4℃透析5h，透析2次，合并膜外溶液，冷凍干燥。最后得鱉甲干燥粉末為淡黃色絮狀粉末，即為鱉甲的抗肝纖維化活性肽類物質(zhì)[5](m<6000)。

1.2.2 鱉甲抗肝纖維化活性部位不同組分的分離 稱取50g葡聚糖凝膠g-25(sephadex g-25)，加入過量雙蒸水，加熱溶脹約2h，放置冷卻至室溫，裝柱。取0.3653g醋鱉甲透析物干燥粉末，用雙蒸餾水8ml溶解，加入色譜柱上端，用蒸餾水洗脫，收集流分，每份10ml，共收集8個流分，即將鱉甲抗肝纖維化活性肽類物質(zhì)分離為8個部位，分別記錄為bj1～bj8，其中bj4、bj6和bj7為活性部位[6]。再稱取70g葡聚糖凝膠g-15(sephadex g-15)，加入過量雙蒸水，加熱溶脹約2h，放置冷卻至室溫，裝柱。取0.4012g bj6樣品，用雙蒸餾水5ml溶解，加入色譜柱上端，用蒸餾水洗脫，收集流分，每份10ml，共收集8個流分，即將鱉甲抗肝纖維化活性部位bj6分離為8個組分。提取分離流程見圖1。

圖1 提取分離流程1.2.3 hsc的培養(yǎng)及傳代 將傳代的hsc-t6培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和1% neaa的high-dmem培養(yǎng)液中，置于37℃、5%co2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長到亞單層或細(xì)胞密度約 80%～90%時，是hsc-t6傳代的標(biāo)志;吸棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶1～2ml， 37℃ 消化2～3min，待細(xì)胞回縮，瓶壁有少量細(xì)胞脫落，即用含血清培養(yǎng)基終止;收集細(xì)胞懸液于50ml消毒離心管中，1700r/min， 4℃離心7min，棄去上清液，加入含 10%胎牛血清的dmem用吸管反復(fù)吹打、分散細(xì)胞，取細(xì)胞懸液光鏡下計數(shù)，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度 ，以 1×105/ml傳代。

1.2.4 mtt比色法測定 hsc增殖 傳代 hsc-t6細(xì)胞按 1×105的密度接種于 96孔培養(yǎng)板，每孔加 100μl，細(xì)胞貼壁長滿孔底12h后，換用 5%fcs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后，分別加入高、中、低劑量bj61～bj68 (以含 5%fcs的 dmem 培養(yǎng)基倍比稀釋成16、8、4mg/ml，用0.45μm濾膜過濾)，4孔重復(fù)，另設(shè)空白對照組(含5%fcs的dmem培養(yǎng)基)。培養(yǎng)72h后，去培養(yǎng)基(翻板)，每孔加20μl mtt溶液。孵育4h，每孔加入 dmso 100μl，在微型混合器上振蕩 2min，10min后于酶標(biāo)儀上0d490值，再按下式計算抑制率：抑制率=(1-藥物組od值 對照組od值)×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果以x±s表示。應(yīng)用單因素方差分析，p<0.05表示差異有顯著性。

2 試驗結(jié)果

傳代培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞系hsc-t6與不同濃度bj61～bj68樣品共同培養(yǎng) 72h后,采用 mtt比色法測定各濃度hsc-t6增殖情況。與空白對照組相比，樣品bj66、bj67在各濃度對hsc-t6細(xì)胞均有抑制作用，其中高、中濃度差異均有顯著性(p<0.05)。結(jié)果見表1。表1 鱉甲bj61～bj68對hsc-t6細(xì)胞增殖的抑制作用

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化甚至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的必經(jīng)階段，是各種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)[7]。在肝纖維化形成的過程中，肝星狀細(xì)胞(hsc)的“持久化”激活和增殖是中心環(huán)節(jié)[8];阻抑激活的 hsc增殖和誘導(dǎo)促進 hsc凋亡是防治肝纖維化的重要措施[9]。在臨床應(yīng)用上，鱉甲為治療肝纖維化的傳統(tǒng)中藥，但鱉甲含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖等物質(zhì)，化學(xué)成分復(fù)雜，因而鱉甲的抗肝纖維化活性單體少見報道。本文在前期實驗的基礎(chǔ)上，采用葡聚糖凝膠g-15對鱉甲的活性部位bj6進行分離，得到bj61～bj68共8個組分，再采用mtt比色法確定bj66、bj67具有明顯抑制大鼠肝星狀細(xì)胞系hsc-t6的增殖作用，即為鱉甲的抗肝纖維化活性組分;該活性組分的化學(xué)成分比bj6少許多，就可以通過制備高效液相色譜分離得到單體，為下一步篩選活性單體打下堅實的基礎(chǔ)。

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